定蟲隆對銹赤扁谷盜生長發育影響及其作用機理初探

魯玉杰，杜夢園，張 蒙，王爭艷

((河南工業大學糧油食品學院，河南糧食作物協同創新中心，糧食儲藏安全河南省協同創新中心，鄭州 450001))

銹赤扁谷盜Cryptolestesferrugineus(Stephens)是當今世界上最難殺死的儲糧害蟲之一，它能夠引起糧食局部發熱霉變(蘇青峰等，2013)。由于其長期單一使用磷化氫，導致銹赤扁谷盜對磷化氫的抗性急劇提高(曹陽，2006)，目前磷化氫熏蒸已經很難徹底殺死銹赤扁谷盜。尋找新型的、對環境友好型的殺蟲劑，已成當務之急。昆蟲生長調節劑殺蟲具有不污染環境、對人畜安全，以及對多數非靶標生物無害的優點(楊惠，2001)，符合新型殺蟲劑的要求。昆蟲生長調節劑的種類很多，其中苯甲酰基脲類幾丁質合成抑制劑以其獨特的作用機制，對非靶標生物具有較高的選擇性、使用濃度低、降解速度快、對環境友好等傳統農業無法比擬的優點，被列為特異性的昆蟲生長調節劑，已成為新農藥創制的一個熱門研究領域(羅會等，2009)。

定蟲隆(chlorfluazuron)是一種苯甲酰基脲類幾丁質合成抑制劑(冒德壽等，2001)，能抑制害蟲的幾丁質合成，阻斷蛻皮過程，致使蛻皮困難、取食量下降(梁英，2009)，從而導致其死亡或不育(李秀峰和李玉新，2001；羅會等，2009)。因其獨特的殺蟲機制、較高的特異性、低殘留等優點，被稱為新型殺蟲劑，常用來防治鱗翅目、鞘翅目等害蟲(米娜等，2009)。研究表明，定蟲隆能有效的抑制谷蠹Rhizoperthadominica、米象Sitophilusoryzae、鋸谷盜Oryzaephilussurinamensis和赤擬谷盜Triboliumcastaneum4種儲糧害蟲的繁殖，具有很好的防治效果(Elek and Logstaff，1994)。相關的研究表明，除蟲脲能有效的抑制蚊子Culicidae幾丁質的合成，使幼蟲不能形成新表皮，致使幼蟲畸形而死亡(Cetinetal.，2006)。氟蟲脲對東亞飛蝗Locustamigratoria的幾丁質合成也有明顯的抑制作用(王貴強等，1996)，從而起到了防治害蟲的效果。苯甲酰基脲類幾丁質合成抑制劑的作用機理可能是特異性的干擾昆蟲表皮幾丁質的合成，但其作用于幾丁質合成中的哪一環節至今尚不清楚。已有研究表明，幾丁質合成抑制劑影響幾丁質合成酶(Postetal.，1974)，也有研究表明定蟲隆并不直接抑制幾丁質合成酶(Gangishettietal.，2009)。關于定蟲隆的具體作用靶標及毒性機理，目前還沒有明確的結論。

定蟲隆作為一種幾丁質合成抑制劑被廣泛應用，而目前對于定蟲隆的研究一般集中在殺蟲活性及農藥殘留方面(朱烈等，2016)，定蟲隆對銹赤扁谷盜產生的影響，及可能的作用靶標尚沒有系統性的研究。本研究以銹赤扁谷盜為對象，通過亞致死劑量的定蟲隆處理銹赤扁谷盜，研究定蟲隆對其生長發育的影響，及可能作用的靶標，為以后定蟲隆用于儲糧害蟲的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試昆蟲

銹赤扁谷盜試蟲來源于山西呂梁國家糧食儲備庫，在河南工業大學儲糧生態研究室的人工氣候室培養多代，飼養溫度30℃±1℃，相對濕度60%±5%，選擇同一時間孵化的幼蟲，轉移至玻璃瓶中，飼喂人工飼料，飼料為全麥粉 ∶燕麥 ∶酵母粉的比例為5 ∶4 ∶1。

1.1.2主要試劑與儀器

定蟲隆：含量99%，CSSBIO(中國)提供；RNA提取試劑盒Total RNA Miniprep Kit購自Axygen公司；熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq購于TaKaRa公司；熒光定量PCR儀Step One Plus Real Time PCR(Thermo Fisher Scientific美國)。PCR引物合成由蘇州金唯智生物科技公司完成。

1.2 定蟲隆對銹赤扁谷盜的毒力測定

取1 mg定蟲隆粉劑，用1 mL丙酮溶解，配制1 mg/mL定蟲隆母液。在潔凈的培養皿中，每10 g全麥粉(含5%酵母粉)中加入10 mL含有所需量定蟲隆的丙酮溶液，將飼料配制成0.0050 mg/kg、0.0091 mg/kg、0.0166 mg/kg、0.0302 mg/kg、0.0549 mg/kg、0.1000 mg/kg 6個濃度梯度，并將懸浮液攪拌搖勻，然后將溶液放在通風櫥下，直至丙酮完全揮發。使用和上述完全一樣的飼料，只添加丙酮作為對照。每組放入30頭銹赤扁谷盜2齡幼蟲，每個濃度3個重復。每天記錄幼蟲死亡數并觀察表型變化。

1.3 亞致死劑量下定蟲隆對銹赤扁谷盜生長發育的影響

根據定蟲隆對銹赤扁谷盜的毒力方程計算出銹赤扁谷盜的亞致死劑量LD10、LD20、LD30。用同樣的飼喂方法，分別用LD10、LD20、LD303個濃度的定蟲隆處理銹赤扁谷盜2齡幼蟲，以丙酮作為對照，觀察LD10、LD20和LD30下，定蟲隆對銹赤扁谷盜幼蟲發育歷期、體重、幾丁質含量的影響。幾丁質含量測定采用氨基葡萄糖法(Lehmann and White，1975)。

1.4 定蟲隆對幾丁質合成酶表達量的影響

根據本實驗室得到的銹赤扁谷盜幾丁質合成酶1基因(CfCHS1)的轉錄組數據，和已經提交到GenBank的銹赤扁谷盜幾丁質合成酶2基因(CfCHS2)的全長序列(GenBank登錄號：MH234580)，設計熒光定量PCR引物(表1)。以同樣的飼喂方法，用LD30劑量的定蟲隆處理銹赤扁谷盜3齡幼蟲，每組30頭蟲，3組重復，以丙酮處理為對照。提取定蟲隆LD30處理48 h后的銹赤扁谷盜3齡幼蟲總RNA，反轉錄成cDNA，進行熒光定量PCR。qPCR反應體系：cDNA模板2 μL(<100 ng)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，PCR上引物(10 μM)0.8 μL，PCR下引物(10 μM)0.8μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6 μL，總反應體系為20 μL。反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，72℃，30 s，40個循環。每組樣品進行3個重復，以目的基因在對照組中的表達量為1，以ARF1為內參基因。

表1 本文中所用引物的名稱、序列

1.5 數據統計與分析

死亡率(%)=(死亡數/總蟲數)×100

校正死亡率(%)=[(處理組死亡率-對照組死亡率)/對照組存活率]×100

統計分析采用SPSS軟件進行統計分析和檢驗，P=0.05。

qPCR結果采用比較CT值得相對表達量法(2-ΔΔCt)計算基因的相對表達量。實驗結果以平均數±標準差(SD)表示。表達量的差異顯著性比較采用SPSS軟件中的單因素方差分析(ANOVA，Tukey氏多重比較法，P<0.05)進行。

2 結果與分析

2.1 定蟲隆對銹赤扁谷盜的殺蟲活性

根據生物測定結果，將其與劑量對數值進行回歸分析，建立定蟲隆毒力方程：y=7.514+1.81x，r=0.974，計算得LD50為0.041 mg/kg，95%置信區間為0.025～0.059 mg/kg；LD95為0.331 mg/kg，95%置信區間為0.270～5.832 mg/kg。亞致死劑量LD10、LD20、LD30分別為0.008 mg/kg、0.014 mg/kg、0.021 mg/kg。

2.2 亞致死劑量定蟲隆對銹赤扁谷盜生長發育的影響

經過亞致死劑量定蟲隆處理的銹赤扁谷盜幼蟲，各個發育歷期以及蛹期的天數都是有所增加的。隨著定蟲隆劑量的增加，銹赤扁谷盜的發育歷期明顯延長(表2)。定蟲隆劑量越高，處理時間越長，銹赤扁谷盜體重下降越顯著；經定蟲隆LD30長期處理的銹赤扁谷盜，體重可下降25%(表3)。低劑量的定蟲隆就可以導致銹赤扁谷盜幾丁質含量顯著下降(P<0.05)(圖1)。

表2 不同濃度定蟲隆處理后銹赤扁谷盜各蟲態的發育歷期

注：同列中不同的字母代表發育歷期差異顯著(P<0.05，Tukey’s B；n=3)。
Note: Different letters in the same column represent significant differences in development duration (P<0.05, Tukey’s B; n=3).

表3 不同濃度定蟲隆處理后銹赤扁谷盜各蟲態的體重

注：同列中不同的字母代表體重差異顯著(P<0.05，Tukey’s B；n=3)。
Note: Different letters in the same column represented significant differences in body weight (P<0.05, Tukey’s B; n=3).

圖1 定蟲隆處理后銹赤扁谷盜各蟲態幾丁質的含量Fig.1 Content of chitin in different stages of Cryptolestes ferrugineus after treatment with chlorfluazuron注：柱上標的不同字母代表幾丁質含量差異顯著(P < 0.05，Tukey’s B；n=3)。Note: Different letters of the superscript on the column represent significant differences in the content of chitin (P < 0.05, Tukey’s B; n=3).

2.3 定蟲隆處理后銹赤扁谷盜幾丁質合成酶基因表達量的變化

用LD30定蟲隆處理銹赤扁谷盜3齡幼蟲，幾丁質合成酶基因表達量的變化如圖2所示。從圖2可以看出，CfCHS1基因的表達量明顯上調，是對照組的1.787倍。CfCHS2基因的表達量也明顯上調，是對照組表達量的1.274倍。說明了定蟲隆可以顯著提高銹赤扁谷盜幾丁質合成酶CfCHS1和CfCHS2基因的表達量。

圖2 定蟲隆處理后銹赤扁谷盜3齡幼蟲幾丁質合成酶CfCHS1和CfCHS2基因的表達量Fig.2 Expression level of chitin synthase CfCHS1 and CfCHS2 in the third instar larvae of Cryptolestes ferrugineus treatment with chlorfluazuron注：CK代表對照組，LC30代表處理組。數據均代表3次生物學重復的平均值±標準差。柱上標的不同字母代表基因表達差異顯著(P<0.05，Tukey’s B；n=3)。Note: The data are means±SD.Histograms with different letters indicate statistically significant difference (P < 0.05, Tukey’s B; n=3).

3 討論與結論

目前關于苯甲酰基脲抑制劑的亞致死效應研究相對較少，其作用機制也尚不清楚。本研究選取定蟲隆進行試驗，使用亞致死劑量持續處理銹赤扁谷盜幼蟲，發現其各個蟲態的發育歷期都明顯延長，體重下降，幾丁質含量減少，并出現畸形死亡個體，這一結果與除蟲脲對中華稻蝗Oxyachinensis的影響(曾慧花等，2008)相同，與滅幼脲能顯著降低家蠅Muscadomestica幾丁質的含量(Ishaaya and Casida，1974)的結果也是一致的。這說明定蟲隆作為幾丁質合成抑制劑，的確抑制了銹赤扁谷盜幼蟲幾丁質的合成，但發育歷期的延長，和體重的下降，暗示著定蟲隆可能對幼蟲產生其他影響。

在滅幼脲處理家蠶Bombyxmori和四斑按蚊Anophelesquadrimaculatus中，其幼蟲的體重均顯著減少(Leonardietal.，1996；Zhuetal.，2006)，這與本研究的結果相同。在除蟲脲對中華稻蝗的研究中發現，除蟲脲不僅抑制了中華稻蝗的體重的增長，還對其進食產生了抑制(曾惠花等，2008)。Clarke用除蟲脲處理東亞飛蝗，發現除了表皮結構外，東亞飛蝗圍食膜中的幾丁質合成也受到了抑制(Clarkeetal.，1977)。根據前人的研究，幾丁質合成酶2參與中腸圍食膜的形成(Merzendorfer，2006)。劉曉健利用RNAi干擾技術，對飛蝗幾丁質合成酶2基因進行沉默，其試蟲的取食量也明顯減少，體重降低(劉曉健等，2014)。根據大量研究推測，定蟲隆可能對銹赤扁谷盜幾丁質合成酶2產生影響，使其不能正常反應，致使圍食膜的形成受到影響，從而產生了與RNAi干擾相似的結果。

為了探究定蟲隆作用機理，本文在用定蟲隆處理銹赤扁谷盜之后，利用qPCR技術，測定了幾丁質合成酶基因相對表達量的變化。結果顯示，亞致死劑量定蟲隆處理后，銹赤扁谷盜幾丁質合成酶1和酶2的表達量顯著提高。為什么定蟲隆可以使幾丁質合成酶基因的表達量提高？我們推測，定蟲隆可能作用于銹赤扁谷盜幾丁質合成酶。定蟲隆抑制了幾丁質合成酶，使其不能正常的進行幾丁質的合成，從而引起幾丁質合成受阻，銹赤扁谷盜為了維持機體的穩定，提高幾丁質合成酶基因的表達量，從而形成一種代償性增加的反饋機制。Zhang and Zhu(2006)使用除蟲脲處理四斑按蚊，發現其AqCHS1的表達量增加也顯著提高。在氟蟲脲對東亞飛蝗和中華稻蝗處理后，其CHS1基因的表達量都有顯著的升高(劉曉健等，2010)。至于定蟲隆是如何作用于幾丁質合成酶，幾丁質含量的減少與幾丁質合成酶表達量增加之間的關系，需要我們進一步去研究。

本研究用定蟲隆處理銹赤扁谷盜，結果表明定蟲隆對銹赤扁谷盜的生長發育有明顯的抑制作用，可以有效控制銹赤扁谷盜，至于如何在儲糧環境中使用定蟲隆，還有待進一步的研究，并需符合農藥管理相關要求。定蟲隆在抑制幾丁質合成的同時，也使銹赤扁谷盜的幾丁質合成酶基因表達量提高，這表明定蟲隆可能作用于幾丁質合成途徑中的幾丁質合成酶。這為以后利用定蟲隆防治銹赤扁谷盜提供理論基礎。