云南普洱江城縣草地貪夜蛾幼蟲腸道中可培養細菌的分離及鑒定

張凌英，蘇造堂，徐天梅，張志紅，鄭亞強，桂富榮，2**，陳 斌*

(1. 云南農業大學植物保護學院, 昆明 650201；2. 云南省高原特色農業產業研究院, 昆明 650201)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(Smith)又名秋粘蟲，隸屬于鱗翅目Lepiodoptera夜蛾科Noctuidae。它是一種源于美洲大陸的毀滅性農業害蟲，具有飛行能力強、增殖數量大、寄主種類多、種群優勢明顯、突發危害嚴重等特點(Todd and Poole，1980)。該蟲于2019年1月首次遷入我國云南省普洱市江城縣(楊學禮等，2019)，之后迅速向我國其他省區蔓延，現已成為嚴重影響玉米生產的重要害蟲(齊國君等，2019)。張麗紅(2019)研究發現該蟲對很多農藥如有機磷類、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類具有抗藥性，防治困難。

昆蟲腸道存在著種類多、數量大的微生物類群，這些微生物與昆蟲行為有著密切聯系，比如在躲避天敵(張振宇，2017)、增強抗藥性(Chengetal., 2017)及適應生態位變化(Chengetal., 2019)等過程中具有重要作用。為了適應不同環境條件，這些微生物也隨之發生進化，然而腸道微生物的多樣性與昆蟲的種類、地域、食物及外界環境等有關(Corbyharrisetal., 2007; Zhangetal., 2018)，導致同種昆蟲會因其食物、地理環境或者生長發育的差異而表現出種類和數量不同的微生物，也表現出不同種昆蟲在取食相同食物、經歷相同的環境變化及同一地區其腸道中微生物的種類和數量也不同(Chenetal., 2018)。昆蟲體內大部分細菌屬于變形菌門，但是多數研究表明，厚壁菌門同樣是鱗翅目昆蟲腸道中的優勢菌群(陳勃生等，2017)。國外，美國和巴西已對草地貪夜蛾腸道微生物開展了研究(Acevedoetal.，2017；Almeidaetal.，2017)，而國內相關研究報道較少。本研究采集江城縣寶藏鎮水城村勐野壩地區玉米田中的草地貪夜蛾為樣本，通過傳統培養法以及16S rRNA測序對草地貪夜蛾的腸道優勢菌進行了初步分離鑒定，以期為后續的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料

蟲源：采集于江城縣寶藏鎮水城村勐野壩玉米田，海拔790 m，E101.63°，N22.68°。

LB培養基：10 g氯化鈉，5 g酵母浸粉，10 g胰蛋白胨，15～20 g瓊脂，pH7.0，dd H2O：1 L，121℃高壓(101 kPa)蒸汽滅菌20 min(黃秀梨和辛明秀，2008)。

NA培養基：5 g氯化鈉，5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，15～25 g瓊脂，pH7.4～7.6，dd H2O：1 L，121℃高壓(101 kPa)蒸汽滅菌20 min(黃秀梨和辛明秀，2008)。

試驗儀器：超凈工作臺(蘇凈安泰，SW-CJ-1FD)、高壓蒸汽滅菌鍋(申安，LDZM-40KCS-Ⅱ)、恒溫培養箱(恒立，RG-300)、離心機(恒諾，2～16R)、PCR儀(美國伯樂，T100)、電泳儀(美國伯樂，1645050 )、顯微鏡(德國萊卡，ICC50W)。

1.2 研究方法

1.2.1草地貪夜蛾中腸腸道原液的制備

取5頭健康的草地貪夜蛾5齡幼蟲，饑餓1 d，用無菌水清洗幼蟲體表的污染物，再用75%消毒酒精對幼蟲體表消毒4 min，最后放入無菌水中清洗表面的酒精。在放有滅菌的磷酸緩沖液的滅菌培養皿中，用鑷子從蟲體尾部取出腸道，用鑷子小心去除前腸和后腸以及部分馬氏管，將處理好的中腸放入1.5 mL無菌離心管中并用尖鑷子搗碎，加入少量滅菌的磷酸緩沖液使搗碎的腸道成勻漿狀，最后繼續加入磷酸緩沖液定容至1 mL，以此作為腸道原液備用(鄭亞強等，2017)。

1.2.2腸道原液中細菌的分離及純化

將準備好的腸道原液取0.1 mL于含有0.9 mL磷酸緩沖液離心管配制成10-1，按照此方法依次類推分別稀釋到10-3～10-8稀釋濃度梯度。用移液槍分別從6個濃度梯度中從低到高取0.1 mL均勻涂布于兩種固體培養基，重復3次。把涂布好的固體培養基放置于30℃恒溫條件下培養，24 h后挑選出菌落數在30～300的平板，統計各平板上菌落顏色、形態和大小各異細菌菌落的數量，并用接種環挑取不相同的單菌落多次平板劃線，直到獲得純菌株。將純化好的菌株分別編號，并且對每個編號下的菌株進行革蘭氏染色，通過萊卡顯微鏡(100×物鏡)觀察。

1.2.3細菌菌株分子鑒定及系統發育分析

本研究采用凍溶法提取細菌DNA，具體操作如下：分別從已經純化好的LB或者NA平板中挑取單菌落于1.5 mL無菌離心管中，然后加入0.5 mL無菌蒸餾水渦旋振蕩混勻。然后將混勻后的菌懸液于裝有液氮的冰盒中冷凍10 min，緊接著將離心管固定在泡沫漂盤上沸水浴5 min，最后 12 000 r/min高速離心2 min(馮廣達等，2013)，以上清液作為PCR模板。

1.2.4采用細菌通用引物27F和1492R(鄭亞強等，2017)，擴增體系與條件如下：

反應條件: 94℃熱變性5 min；94℃變性1 min；53℃退火1 min；72℃延伸2 min；32個循環，72℃延伸10 min。

PCR產物經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將達標PCR產物送上海生物工程股份有限公司進行雙向測序。

表1 PCR 反應體系

1.3 數據分析

計算每種菌菌株的相對豐度，計算公式為：相對豐度(%)=某種菌菌落數/總菌落數×100。

利用Contigexpress軟件對雙向測序原始序列進行拼接和校對，并切除首尾亂序形成一條較為完整的序列，提交至NCBI(GenBank)數據庫進行比對，查找并下載與各菌株具有最高相似度的同源序列。將下載的序列通過MEGA 7.0軟件，采用通用的鄰位相連法(Neighbour-Joining)、Kimura雙參數矯正模型構建系統發育樹，各分支的Bootstrap置信度用1 000次自導復制評價系統發育樹的穩定性。

2 結果與分析

2.1 草地貪夜蛾腸道可培養細菌的形態學特征

從稀釋涂布培養的LB和NA培養基上得到菌落形態各異的18個細菌菌株。其中共有12種典型的顏色、形狀、大小各不相同的細菌菌落，其菌落的形態為圓形和不規則形，且圓形較多；顏色有白色、乳白色、黃色、淡黃色、紅色(表2)。通過革蘭氏染色后，11株顯示為陽性，7株顯示為陰性。100×物鏡下觀察到其細胞形態10株為球形，4株為桿狀，3株為短桿狀，1株為棒狀。

2.2 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道細菌的16S rRNA序列分析結果

將草地貪夜蛾腸道中分離得到的18株可培養細菌通過16S rRNA序列分析法進行鑒定，將校對好的測序結果與NCBI中模式菌株序列進行相似性對比。結果如表3所示，它們分別屬于2門2綱4目 6科8屬：與腸球菌屬Enterococcus相似性在99%以上的有8株、與芽孢桿菌屬Bacillus相似性在99%以上的有1株、與巨球菌屬Macrococcus相似性在99%以上的有1株、與葡萄球菌屬Staphylococcus相似性在99%以上的有1株、與普羅威登斯菌屬Providencia相似性在99%以上的有1株、與克雷伯氏菌屬Klebsiella相似性在99%以上的有2株、與沙雷氏菌屬Serratia相似性在99%以上的有2株、與不動桿菌屬Acinetobacter相似性在99%以上的有1株。

表2 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道細菌的菌落形態及培養性狀

續表2 Continued table 2

菌株編號Strain No.革蘭氏染色Grams dyeing菌體形狀Strain morphology培養特征Culture characterNR03+球形Spherical圓形,邊緣規則透明,乳白,凸起,濕潤,較小。Round,Regular and transparent edges,Creamy White,Bulge,Moist,Smaller.105341+球形Spherical圓形,邊緣規則,淡黃色,扁平,半透明,濕潤,較小。Round,Regular edge,Yellowish,Flat,Translucent,Moist,Smaller.105142+球形Spherical圓形,邊緣規則,淡黃色,扁平,半透明,濕潤,較小。Round,Regular edge,Yellowish,Flat,Translucent,Moist,Smaller.104122+球形Spherical圓形,邊緣規則,淡黃色,扁平,半透明,濕潤,較小。Round,Regular edge,Yellowish,Flat,Translucent,Moist,Smaller.105321+球形Spherical圓形,邊緣規則,黃色,扁平,半透明,濕潤。Round,Regular edge,Yellow,Flat,Translucent,Moist.104242+球形Spherical圓形,邊緣規則,黃色,扁平,半透明,濕潤。Round,Regular edge,Yellow,Flat,Translucent,Moist.103311+桿狀Rod-shaped圓形,邊緣放射狀透明,淡黃色,扁平,不透明,半濕潤。Round,Ra-dially transparent margin,Yellowish,Flat,Opaque,Semi humid.10351+球形Spherical圓形,邊緣規則,黃色,凸起,不透明,濕潤。Round,Regular edge,Yellow,Bulge,Opaque,Moist.NR05+球形Spherical不規則,邊緣細小瓣狀,黃色,中央微凸有褶皺,不透明,濕潤。Irregu-lar,Edge small petal,Yellow,Center slightly convex with fold,Opaque,Moist.NR01-桿狀Rod-shaped圓形,邊緣規則,黃色到淡黃,凸起,不透明,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,Yellow to yellowish,Bulge,Opaque,Moist,Glossy.10412-短桿狀Short rod圓形,邊緣規則,白色,高凸,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,White,High bulge,Moist,Glossy.NR04-短桿狀Short rod圓形,邊緣規則,白色,高凸,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,White,High bulge,Moist,Glossy.104111-短桿狀Short rod圓形,邊緣規則,白色,高凸,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,White,High bulge,Moist,Glossy.10461-桿狀Rod-shaped圓形,邊緣規則,深紅,高凸,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,Crimson,High bulge,Moist,Glossy.NR02-桿狀Rod-shaped圓形,邊緣規則,初期深紅后期四周褪色,高凸,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,Early crimson and late four week fading,High bulge,Moist,Glossy.NR06-棒狀Stick-shaped圓形,邊緣規則,白色,凸起,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,White,Bulge,Moist,Glossy.

注：其中編號為10351-105341為LB培養基分離得到的菌株，編號為NR01-NR06為NA培養基分離得到的菌株。
Note: The strains numbered 10351-105341 were isolated from LB medium and NR01-NR06 was isolated from NA medium.

表3 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道細菌的16S rRNA序列比對分析結果

注：其中編號為10351-105341為LB培養基分離得到的菌株，編號為NR01-NR06為NA培養基分離得到的菌株。
Note: The strains numbered 10351-105341 were isolated from LB medium and NR01-NR06 was isolated from NA medium.

2.4 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道細菌鑒定結果

綜合各菌株的培養性狀、菌體形態和染色反應等各項指標，共鑒定出細菌2門2綱4目6科8屬。其中從LB培養基中分離到2門2綱3目 4科 5屬，分別為腸球菌屬、芽孢桿菌屬、巨球菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬，其中腸球菌屬所占比例最高為65.06%。從NA培養基中分離到2門2綱4目6科6屬，分別為腸球菌屬、葡萄球菌屬、不動桿菌屬、普羅威登斯菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬，其中腸球菌屬所占比例同樣最高為44.20%(圖1)。可以確定腸球菌屬是草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道中的優勢屬，且種水平多樣性最高。通過LB培養基和NA培養基獲得隸屬于該屬的菌株有3種，分別為蒙氏腸球菌Enterococcusmundtii、鉛黃腸球菌Enterococcuscasseliflavus和鶉雞腸球菌Enterococcusgallinarum(表4)。

表4 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道可培養細菌鑒定結果及存在數量

圖1 LB(A)和NA(B)培養基上分離細菌在屬分類水平的群落組成Fig.1 The composition of bacteria community isolated from LB(A)and NA(B)media at genus level

3 結論與討論

本研究通過細菌通用培養基LB培養基和NA培養基從草地貪夜蛾中腸中總共分離到18株細菌，隸屬于2門2綱4目6科8屬。在門水平上本研究分離得到的兩個門分別是變形菌門和厚壁菌門，這與Snyman等(2016)報道的在鱗翅目昆蟲腸道中微生物的優勢門具有一致性。在屬水平上，所分離到的菌株分別為腸球菌屬、芽孢桿菌屬、巨球菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、萄球菌屬、普羅威登斯菌屬、不動桿菌屬，其中腸球菌屬的豐度最高，分別占LB培養基和NA培養基所有分離菌株的65.06%和44.20%，可以確定該屬是云南江城地區草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道中的優勢屬。據報道，腸球菌屬有很多種類能夠產生乙酸鹽，進一步調節昆蟲腸道內的pH值，起到保護昆蟲免被毒素毒害的功能(張玨鋒等，2013)；克雷伯氏菌屬的一些菌株可降解部分有機磷殺蟲劑如：毒死蜱、敵百蟲；同時也能降解少部分菊酯類殺蟲劑如：溴氰菊酯。不動桿菌屬細菌的一些菌株可降解溴氰菊酯(南春燕，2013)。然而，草地貪夜蛾腸道中分離到的這些細菌是否具有降解農藥的作用，值得進一步深入探究。

國外，巴西學者從大豆飼養的草地貪夜蛾 5齡幼蟲腸道中分離到8個屬的細菌(Almeidaetal.，2017)，分別為腸球菌屬Enterococcus、節細菌屬Arthrobacter、勒克氏菌屬Leclercia、細桿菌屬Microbacterium、代爾夫特菌屬Delftia、假單胞菌屬Pseudomonal和葡萄球菌屬Staphylococcus。美國從玉米葉飼養第14代的草地貪夜蛾3齡幼蟲腸道中分離到5個屬的細菌，分別為腸桿菌屬Ebterbacter、拉恩氏菌屬Rahnella、克雷伯氏菌屬Klebsiella、拉烏爾菌屬Raoutella、和泛菌屬Pantoea(Acevedoetal.，2017)。我國唐運林等(2019)對采自重慶玉米地的草地貪夜蛾幼蟲腸道中發現8個屬的細菌，分別為克雷伯氏菌屬Klebsiella、假單胞菌屬Pseudomonas、不動桿菌屬Acinetobacter、氣單胞菌屬Aeromonas、腸桿菌屬Enterobacter、金黃桿菌屬Chryseobacterium、短波單胞菌屬Brevundimonas以及腸球菌屬Enterococcus。與巴西、美國、及重慶3個地方的研究相比，云南江城地區與以上地區的草地貪夜蛾腸道細菌存在一定的重合性，這可能是由于同一物種腸道微環境具有一定保守性導致的。同時也存在明顯差異性，芽孢桿菌屬Bacillus、沙雷氏菌屬Serratia、巨球菌屬Macrococcus、普羅威登斯菌屬Providencia等4個屬在云南省江城縣玉米田草地貪夜蛾腸道中分離獲得，而在文獻報道的其他地區未分離到，究其原因可能與地理位置、宿主植物、飼養代數以及齡期等差異有關，然而具體原因將是進一步研究的重要內容。此外，昆蟲腸道細菌是影響昆蟲生長發育、抗藥性和遷飛等習性的重要因素(張振宇等，2017)，然而草地貪夜蛾腸道中這些細菌是否也會影響草地貪夜蛾的抗性和生長發育等，還有待進一步研究。