棉鈴蟲幾丁質合成酶1基因的時空表達分析及氟啶脲對其表達的影響

臺術蕾,馬 龍,張春妮

(西北農林科技大學植物保護學院,陜西楊凌 712100)

幾丁質(Chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl glucosamine, GlcNAc)聚合而成的多糖單分子聚合物，是無脊椎動物外殼以及真菌藻類細胞壁的重要組成成分，在個體生命活動中發揮著重要的作用(Merzendorfer and Zimoch, 2003; Merzendorfer, 2011; Wangetal., 2012; Tetreauetal., 2015)。在昆蟲中，幾丁質是表皮、氣管以及中腸圍食膜等結構的重要組成物質(Merzendorfer, 2006，2011)。幾丁質合成酶(chitin synthase, CHS)主要作用于幾丁質代謝過程，對昆蟲生長發育發揮關鍵作用。它與幾丁質降解酶系共同作用，維持昆蟲幾丁質水平的動態平衡(Kramer and Koga, 1986；樊東等，2005；劉曉健等，2014)。

目前研究發現，昆蟲中的幾丁質合成酶主要由幾丁質合成酶1(CHS1)和幾丁質合成酶2(CHS2)兩個基因編碼，二者存在于同一條染色體上，可能從同一祖先的基因復制進化而來(Zimoch and Merzendorfer, 2002; Arakaneetal., 2004; Hogenkampetal., 2005; Merzendorfer, 2006；張文慶等，2011；劉曉健等，2014)。CHS1和CHS2基因在昆蟲體內具有不同功能，其中CHS1基因主要負責外胚層相關細胞如氣管細胞的幾丁質合成，其在氣管和表皮等組織中高度表達，而CHS2基因則參與圍食膜細胞中幾丁質的合成，主要在昆蟲中腸上皮細胞中表達(Tellametal., 2000; Gagouetal., 2002; Devineetal., 2005; Zimochetal., 2005; Hogenkampetal., 2005; Merzendorfer, 2006；張文慶等，2011；劉曉健等，2014)。有研究表明，果蠅DrosophilamelanogasterDmCHSA在幼蟲蛻皮和成蛹過程中表達量很高(Gagouetal., 2002)。煙草天蛾Manducasexta中，MsCHSA在幼蟲蛻皮期和蛹中期表達較高(Zhuetal., 2002)。

氟啶脲(chlorfluazuron)是一種苯甲酰基脲類殺蟲劑(benzoylphenylureas insecticides, BUPs)，作用于害蟲的幾丁質合成過程(楊光富等，1999；楊惠和張金桐，2001；米娜等，2009；馬龍等，2014)，對鱗翅目害蟲具有較好的防治效果。由于幾丁質合成酶是昆蟲生長發育過程中的關鍵性酶(劉曉健等，2014)，其作為苯甲?；孱悮⑾x劑的潛在藥物靶標一直備受關注(Merzendorfer and Zimoch, 2003；劉曉健等，2010)。棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)屬于鱗翅目夜蛾科，是重要的世界性農業害蟲之一；不僅嚴重影響棉花生產，還可危害十字花科、豆科、茄科甚至禾本科植物(Martinetal., 2005)。目前尚未有關于棉鈴蟲幾丁質合成酶功能研究的報道。為此，本研究以棉鈴蟲為研究對象，通過實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)分析方法明確棉鈴蟲幾丁質合成酶基因1(HaCHS1)在不同的發育時期和組織的表達情況，測定了苯甲?；孱悮⑾x劑氟啶脲對棉鈴蟲HaCHS1表達水平的影響，以期為研究棉鈴蟲HaCHS1基因的功能研究奠定良好的基礎，同時為棉鈴蟲生長發育過程中機制的探索及基于幾丁質合成途徑中關鍵靶點的新藥研發提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

棉鈴蟲敏感品系由本實驗室采用人工飼料飼養，飼養條件：溫度27±1℃，相對濕度70%±5%，光照周期(L ∶D)為16 h ∶8 h，用10%蜂蜜水供給成蟲營養。

1.2 棉鈴蟲幾丁質合成酶基因1的克隆

按照RNAiso Plus(TaKaRa)試劑說明書，對棉鈴蟲3齡幼蟲進行總RNA的提取，取1.0 μg總RNA作為模板，按照PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒說明書，反轉錄合成cDNA第一鏈。

采用cDNA末端快速擴增(rapid amplification cDNA ends, RACE)技術，基于實驗室前期獲得的棉鈴蟲幾丁質合成酶1基因片段序列，分別在3′端設計特異性上游引物CHS1-3F1(5′-TGAGCC AATCGGTTTAGTGTTCGTGT-3′)和CHS1-3F2(5′-ACGATTATGACAACGACTCGGGCTC-3′)，然后分別與3′ RACE擴增中的錨定引物3 R-outer和3 R-inner組合，進行巢式PCR，獲得HaCHS1基因3′端cDNA序列。在5′端設計特異性下游引物CHS1-5R1(5′-CGTGAAAGCAAGCCAAGTATCG-3′)和CHS1-5R2(5′-CCACATCCACGCCACTCGCTCT-3′)，分別與5′ RACE實驗中的接頭引物5 R-outer和5 R-inner組合，進行巢式PCR，獲得HaCHS1基因5′端cDNA序列。將測序獲得的3′端片段、5′端片段及中間保守區域序列由Contig Express(http://www.invitrogen.com)軟件重新組裝后獲得棉鈴蟲幾丁質合成酶1基因全長cDNA序列。根據這段序列設計引物ORF1(5′-AACATGGCGACGTCGGG AGG-3′)和ORF2(5′-CATTTAAAATCTACCCT GGAAGG-3′)用于ORF序列的驗證。PCR擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸5 min，35個循環，72℃延伸10 min。擴增產物經凝膠回收后與pMD-18T載體連接，轉化感受態細胞DH5α，菌落PCR鑒定正確后進行測序。

1.3 生物信息學分析

采用在線軟件ProtParam(http://web.expasy. org/protparam/)對蛋白質的分子量和等電點進行預測；利用SignalP-4.0 Server(http://www.cbs. dtu.dk/service/SignalP/)和NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net NGlyc/)分別對信號肽結構和糖基化位點進行分析；運用TMHMM 2.0 Server軟件(http://www.ch.embnet.org/)分析蛋白質跨膜區；采用NCBI在線工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)對蛋白質進行同源搜索；應用MEGA 5.05軟件Neighbor-Joining法進行系統進化關系的分析。

1.4 HaCHS1基因在不同發育時期和組織中的表達

1.4.1RNA提取與cDNA合成

收集生長狀況良好且蟲體大小均一的1齡、2齡幼蟲、3～6齡的第1～3天幼蟲、預蛹期及第1、2和3天蛹，共3個生物學重復。另外，取棉鈴蟲6齡中期幼蟲15～20頭，借助體視顯微鏡在生理鹽水中迅速解剖，分離棉鈴蟲頭部、馬氏管、氣管、中腸、表皮和脂肪體等組織，共3個生物學重復。材料收集后立即放于液氮中冷激，后保存于-80℃冰箱備用。

按照RNAiso Plus(TaKaRa)試劑說明書，對各組樣品進行總RNA的提取及純化，取1.0 μg總RNA作為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒說明書，反轉錄合成cDNA第一鏈。

1.4.2實時熒光定量PCR檢測

根據獲得的棉鈴蟲HaCHS1a基因序列設計RT-qPCR特異性引物CHS1-QF：5′-GGTTTAGTGT TCGTGTTTT-3′和CHS1-QR：5′-GCATTCTTATCTA GCAGAGC-3′。同時以EF-1α(GenBank登錄號：AY325496)為內參基因。20 μL反應體系：10×cDNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL(10 mM)，2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，7 μL ddH2O。反應在iQ 5實時定量PCR儀(美國伯樂公司)上進行，PCR反應條件為：95°C 10 min；95°C 15 s，52°C 30 s，72°C 30 s，共40個循環；根據熔解曲線，確定引物及擴增特異性。實驗設置3個生物學重復，并進行3次技術重復。RT-qPCR的檢測結果采用Ct值的相對定量法(2-ΔΔCt)計算基因的相對表達量(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.5 氟啶脲對HaCHS1基因表達的影響

實驗室前期數據計算得出氟啶脲LC10為60 mg/L。參照馬龍等(2014)的方法：挑選大小一致、生長狀態良好的棉鈴蟲3齡中期幼蟲，饑餓處理8 h，隨后將試蟲在氟啶脲LC10(60 mg/L)藥劑中直接浸藥10 s取出，放于干凈的濾紙上吸干藥液，隨后放入飼養盒中飼喂新鮮的飼料。以0.1%吐溫處理作為對照，設3組生物學重復，每組15頭試蟲。飼喂處理24 h、48 h、72 h后分別收集對照組和處理組棉鈴蟲，然后提取整蟲RNA，進行cDNA第一鏈的合成及實時熒光定量PCR檢測，具體方法和步驟同1.4.1和1.4.2。

1.6 數據分析

試驗數據以“平均值±標準誤(SE)”表示。采用SPSS 17.0軟件對時空表達試驗數據進行單因素方差分析；用studentt-test方法對藥劑處理前后的表達數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 HaCHS1基因的生物信息學分析

通過RT-PCR和RACE技術克隆獲得棉鈴蟲HaCHS1基因全長cDNA序列(GenBank登錄號：MK568465)。HaCHS1全長為5 247 bp，ORF為4 698 bp，編碼1 565個氨基酸，5′非翻譯區為168 bp，3′非翻譯區為381 bp。使用在線軟件ExPASy分析發現棉鈴蟲HaCHS1蛋白的理論分子量為180.7 kDa，等電點(pI)為6.50，預測分子式為C14203H23710N4698O5937S1002；使用TMHMM 2.0 Server軟件對其進行跨膜區分析，發現HaCHS1具有16個跨膜螺旋(圖1)，故推測HaCHS1為跨膜蛋白。HaCHS1存在3個結構域：結構域A位于N端，包含9個跨膜螺旋；結構域B在中心區，其含有兩個標簽序列EDR和QRRRW，并且含有兩個其他的保守序列CATMWHET和QMFEY；結構域C位于C端，包含7個跨膜螺旋和另一個標簽序列SWGTR。用NetNGlyc軟件對HaCHS1可能存在的N糖基化位點進行預測，結果顯示，HaCHS1中存在6個N-糖基化位點(NVTL、NISS、NWTS、NDSD、NITY和NISV)，分別位于第359、905、944、1 191、1 306和1 518位氨基酸(圖1)。利用軟件SignalP-4.0 Server進行信號肽預測，發現該蛋白不存在信號肽結構。

圖1 棉鈴蟲HaCHS1基因cDNA序列及推斷的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of HaCHS1 cDNA from Helicoverpa armigera注：起始密碼子(ATG)與終止密碼子(TGA)用黑色著重標示，跨膜區域用陰影部分標示，預測的保守區域用方框標示，下劃線表示糖基化位點。Note: The start codon (ATG), stop codon (TAA) and putative polyadenylation signal (ATTAAA) are highlighted in black. The 16 hydrophobic, transmembrane α-helices predicted by TMHMM Server v.2.0 are shaded. The potential conserved motifs are in box. The 6 putative N-glycosylation sites predicted by PROSCAN are underlined.

2.2 HaCHS1基因的同源性比對及分子系統發育分析

利用ClustalW軟件將棉鈴蟲HaCHS1基因與NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已公布的部分昆蟲的CHS1基因的氨基酸序列進行同源比對分析，結果表明HaCHS1與已知的CHS1基因的氨基酸序列同源性為66%～99%，其中與美洲棉鈴蟲HelicoverpazeaHzCHS1a和HzCHS1b的氨基酸序列同源性最高。

從NCBI數據庫中選取具有代表性昆蟲物種的10種幾丁質合成酶氨基酸序列，利用ClustalX軟件進行完全比對后，再用MEGA 6.06軟件中的Neighbor-Joining方法進行分子系統進化分析，分析得到的昆蟲幾丁質合成酶基因分子進化樹(如圖2)。從系統發育樹的結果可以看出，幾丁質合成酶基因被分為兩支，即幾丁質合成酶1(CHS1)和幾丁質合成酶2(CHS2)。所有鱗翅目昆蟲的幾丁質合成酶1(HaCHS1、HzCHS1、SeCHS1、MsCHS1和PxCHS1)形成了一個亞分支，其中HaCHS1與美洲棉鈴蟲、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)、煙草天蛾Manducasexta和小菜蛾Plutellaxylostella幾丁質合成酶1親緣關系較近，這與傳統上的分類一致。

圖2 基于氨基酸序列構建的棉鈴蟲及其他昆蟲幾丁質合成酶基因CHS的分子進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of insect chitin synthases注：所選生物物種的幾丁質合成酶基因序列包括岡比亞按蚊Anopheles gambiae (AgCHS1, XP_321336), 意大利蜜蜂Apis mellifera (AmCHS1, XP_395677; AmCHS2, XP_001121152), 黑腹果蠅Drosophila melanogaster (DmCHS1, NP524233; DmCHS2, NP001137997), 絲光綠蠅Lucilia cuprina (LcCHS1, AAG09712), 煙草天蛾Manduca sexta (MsCHS1, AAL38051; MsCHS2, AAX20091), 小菜蛾Plutella xylostella (PxCHS1, BAF47974), 甜菜夜蛾Spodoptera exigua (SeCHS1, AAZ03545; SeCHS2, ABI96087), 斜紋夜蛾Spodoptera frugiperda (SfCHS2, AAS12599), 赤擬谷盜Tribolium castaneum (TcCHS1, AAQ55059; TcCHS2, AAQ55061), 美洲棉鈴蟲Helicoverpa zea (HzCHS1, ADX66429).

2.3 HaCHS1基因在棉鈴蟲不同發育時期和組織中的表達分析

選取1齡、2齡幼蟲、3～6齡第1～3天幼蟲、預蛹期及第1、2和3天蛹，對HaCHS1基因的表達進行了分析，發現HaCHS1基因在4齡～5齡幼蟲的中期表達量較低，而在前期或后期表達量較高；在預蛹期表達量最低，在蛹期第一天表達量達到最高，隨后逐漸降低(圖3)。

圖3 幾丁質合成酶1基因(HaCHS1)在棉鈴蟲不同發育時期的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of chitin synthase 1 gene (HaCHS1) in different developmental stages注：以表達量最低P0為1；1L，1齡幼蟲；2L，2齡幼蟲；3L1，3齡幼蟲第1天；3L2，3齡幼蟲第2天；P0，預蛹期；P1，蛹期第一天。柱狀圖上不同的小寫字母表示5%水平差異顯著(Student-Newman-Keuls (SNK)單因素方差分析)。Note: The relative expression was calculated based on the value of the lowest expression which was ascribed an arbitrary value of 1. The age in days of the insects is indicated, e.g., 1L, first-instar larvae; 2L, second-instar larvae; 3L1, first day of third-instar larvae; 3L2, second day of third-instar larvae; P0, the stage of prepupae; and P1, first day of pupae. Different lower-letters above the bars indicate significant differences (P<0.05, Student-Newman-Keuls (SNK) in one way ANOVA).

對棉鈴蟲6齡中期幼蟲不同組織HaCHS1基因表達量進行檢測，結果表明(圖4)，HaCHS1基因在頭部表達量最高，其次是表皮，而在中腸、氣管、馬氏管和脂肪體中的表達量均極低。

圖4 幾丁質合成酶1基因(HaCHS1)在棉鈴蟲不同組織相對表達量Fig.4 Relative expression levels of HaCHS1 in different tissues of Helicoverpa armigera注：以組織最低表達量為1；IN，MG，HE，TR，MT和FB分別表示表皮、中腸、頭部、氣管、馬氏管和脂肪體；柱子表示平均值±SE，3個生物學重復；不同的字母表示差異顯著(P<0.05，Student-Newman-Keuls (SNK)單因素方差分析)。Note: Expression levels in integument (IN), midgut (MG), head (HE), trachea (TR), malpighian tubules (MT) and fatbody (FB) were detected by qPCR. Different letters above the bars indicate significant differences (P<0.05, Student-Newman-Keuls (SNK) in one way ANOVA).

2.4 氟啶脲對棉鈴蟲幾丁質合成酶基因 HaCHS1表達的影響

用LC10濃度(60 mg/L)氟啶脲藥劑處理棉鈴蟲3齡中期幼蟲，利用RT-qPCR對處理后不同時間試蟲體內的HaCHS1基因表達水平進行測定，結果發現(圖5)：氟啶脲處理后HaCHS1基因呈現出“抑制-激活-再抑制”的作用。處理后24 h和72 h，HaCHS1表達水平顯著低于對照(P<0.05)，而在處理后48 h，處理組HaCHS1表達水平則顯著高于對照(P<0.05)。

圖5 氟啶脲處理棉鈴蟲3齡幼蟲后不同時間HaCHS1基因相對表達量Fig.5 Relative expression levels of HaCHS1 after exposure to chlorfluazuron注：表達量最低為1；柱子上的*表示處理組與對照組相比顯著差異P<0.05(Student t-test檢驗)。Note: The lowest expression is ascribed an arbitrary value of 1; * on the column indicates a significant difference between the treatment group and the control group (P<0.05, Student t-test).

3 結論與討論

幾丁質合成酶(CHS)是參與幾丁質生物合成過程的重要酶類，是幾丁質合成途徑最后一步的關鍵酶，在生物體中尤其在昆蟲生長發育等方面發揮著重要作用。本研究克隆獲得棉鈴蟲HaCHS1基因cDNA序列，HaCHS1全長為5 247 bp，ORF為4 698 bp，編碼1 565個氨基酸，預測HaCHS1存在16個跨膜區。煙草天蛾ManducasextaMsCHS1基因編碼1 564個氨基酸，預測存在16個跨膜螺旋(Zhuetal., 2002)。昆蟲幾丁質合成酶基因跨膜螺旋的數目(15～18)比真菌(5～7)多，推測這些豐富的跨膜螺旋可能參與了幾丁質的轉運過程(Zhuetal., 2002; Tellametal., 2000)。HaCHS1存在3個結構域。結構域A位于N端，包含9個跨膜螺旋。不同昆蟲結構域A具有不同數量的跨膜螺旋結構，序列相似性最小?？缒ぢ菪臄盗繘Q定N端位于膜的不同側面，面向細胞外環境或細胞質(Merzendorfer and Zimoch, 2003)。HaCHS1結構域B在中心區，包含兩個獨特的標簽序列，EDR和QRRRW，它們存在于所有類型的幾丁質合成酶中，是催化機制中必不可少的(Merzendorfer and Zimoch, 2003; Tellametal., 2000)；結構域C位于C端，包含7個跨膜螺旋和另一個標簽序列SWGTR，具有較小的序列相似性。

昆蟲的CHS1表達具有明顯的組織特異性。甜菜夜蛾SeCHS1主要在表皮、氣管和中腸組織表達，而在脂肪體和馬氏管表達量很低或幾乎沒有表達(Chenetal., 2007)。梨小食心蟲GrapholithamolestaGmCHS1主要在體壁、頭部和氣管中表達，在中腸中的表達量遠低于體壁(楊靜等，2017)。通過RT-qPCR對棉鈴蟲不同組織HaCHS1基因表達進行了檢測，結果發現該基因主要在棉鈴蟲表皮和頭部組織中表達，而在中腸、氣管、脂肪體和馬氏管等其他組織中表達量很低，結果與先前在東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis(劉曉健，2010；Zhangetal., 2010)、煙草天蛾(Hogenkampetal., 2005)和赤擬谷盜Triboliumcastaneum(Arakaneetal., 2005)中的研究是一致的。

在甜菜夜蛾中，SeCHS1基因在預蛹期表達量較低，而進入蛹期以后表達量又顯著增加(Chenetal., 2007)。此外，在玉米螟Ostriniafurnacalis中也呈現出一致的結果(Qu and Yang, 2011)。本研究結果表明，HaCHS1在4齡和5齡幼蟲的前期或后期表達量較高，而在中期表達較低。在預蛹期表達量最低，但進入蛹期之后表達量急劇上升，且蛹期第一天表達量最高。這就說明HaCHS1在棉鈴蟲蛻皮過程以及從幼蟲期向蛹期變態轉化過程中起著重要的作用，可能參與棉鈴蟲變態過程中幾丁質的合成(Arakaneetal., 2004; Ampasalaetal., 2011；張文慶等，2011)。Arakane等(2005)報道利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)沉默赤擬谷盜TcCHS1基因后，在幼蟲到下一齡幼蟲階段、幼蟲化蛹階段以及蛹羽化為成蟲階段的蛻皮都受到不同程度的影響。抑制中華稻蝗Oxyachinensis的CHS1基因表達后，導致其蛻皮時間延遲，出現不能正常完成蛻皮過程或部分個體腹部皺縮致死的現象(余志濤等，2012)。利用RNAi技術抑制甜菜夜蛾CHS1基因表達后，導致幼蟲出現蛻皮障礙、新的幾丁質層不能正常形成或氣管發育畸形現象(Kramer and Koga, 1986; Chenetal., 2008)。

苯甲?；孱悮⑾x劑能干擾靶標害蟲的幾丁質合成過程，抑制蟲體內幾丁質的合成，從而導致害蟲死亡或不育。研究表明，氟蟲脲(flufenoxuron)能夠上調東亞飛蝗和中華稻蝗中CHS1基因的表達水平(劉曉健等，2010)。然而，氟啶脲處理后小菜蛾CHS1基因表達沒有顯著變化(Ashfaqetal., 2007)，可能與藥劑處理后促進了蛻皮期間表皮的分離和消化有關(Xiaetal., 2014)。本研究結果表明，氟啶脲在亞致死濃度(60 mg/L)下對棉鈴蟲HaCHS1基因呈現出“抑制-激活-再抑制”的作用。此外，除蟲脲diflubenzuron 能夠顯著提高四斑按蚊Anophelesquadrimaculatus(Zhang and Zhu, 2006)、大豆芽Aphisglycines(Bansaletal., 2012)和褐色橘蚜Toxopteracitricida(Shangetal., 2016)中CHS1的表達水平，但對果蠅(Gangishettietal., 2009)和赤擬谷盜(Merzendorferetal., 2012)的CHS1基因表達沒有影響。除蟲脲處理后，四斑按蚊幾丁質合成酶活性降低，導致幾丁質含量減少，CHS1基因表達增加可能是昆蟲體內一種補償酶含量減少的反饋調節機制(Zhang and Zhu, 2006)。由于幾丁質生物合成過程嚴密復雜，昆蟲生長調節劑對其生物合成機制的影響還需進一步研究。