超聲處理對大豆親脂蛋白結構及溶解性的影響

李 楊 王迪瓊 齊寶坤 鐘明明 徐清清 謝鳳英

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

長期以來，大豆分離蛋白(Isolated soybean protein, SPI)被認為由兩種儲存蛋白組成，即大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)，且SPI的功能特性取決于這兩種蛋白質之間的相互作用[1]。大豆儲存蛋白組分中含有一種占SPI 30%左右的親脂性蛋白質(Lipophilic protein, LP)，有望作為天然乳化劑在食品工業中得到廣泛應用[2]。因此，SPI的其他功能特性應基于這3種蛋白質組分的性質重新考慮。文獻[3]研究發現，SPI較低的溶解度可以通過LP的存在來解釋。現有文獻對11S和7S的相關研究較多，對LP的相關研究較少。LP的主要成分是油體蛋白-磷脂，它是油體的原始成分，且具有較強的親油性[2]，可作為乳化劑提高乳液的穩定性。由于LP水溶性差，降低了其乳化效果，因此提高LP溶解性對其應用至關重要。

文獻[4]研究發現，將LP超聲處理5 min可使其在磷酸緩沖液中均勻分散，但未詳細論述不同超聲條件對LP結構及溶解性的影響。目前，國內外對蛋白改性的方法主要有物理法、化學法和酶法等，超聲波改性作為一種有效的物理改性手段被廣泛使用。如文獻[5]采用超聲處理顯著提高了花生分離蛋白的表面疏水性，進而改善其乳化性；文獻[6]采用超聲處理使大豆分離蛋白形成可溶性聚集體，進而提高其溶解度；文獻[7]證明，采用超聲處理可減小液滴尺寸，進而提高小麥蛋白和大豆分離蛋白的乳化性。故超聲可作為提高LP溶解性及結構特性的手段，而目前超聲條件處理對LP的影響研究尚屬空白。

本文探究超聲處理對LP的結構及溶解性的影響，在超聲功率(120～480 W)和超聲時間(10、20 min)處理條件下，研究超聲對LP的物化作用，并確定最佳的超聲條件，在保留LP必要結構特性的基礎上，提高其溶解度及其他功能特性，以期為LP的進一步應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，東北農業大學大豆研究所；氫氧化鈉、氯化鈉，天津市光復精細化工研究所；硫酸，北京新光化工試劑廠；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，天津市東麗區天大化學試劑廠；8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)，美國Sigma公司；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

AL204型分析天平，梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司；CL-2 型恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；6 L落地式凍干機，上海匯分電子科技有限公司；LGR20-W型臺式高速冷凍離心機，北京京立離心機有限公司；Delta320 型pH計，梅特勒-托利多儀器公司；FJ200-SH型數顯高速分散均質機，上海標本模型廠；MAGNA-IR560型傅里葉變換紅外光譜儀，美國NICOLET公司；F-4500型熒光分光光度計，日本HITACHI公司；Q1000型差示掃描量熱儀，美國TA儀器；UV-5100 型高性能紫外可見分光光度計，上海奧析科學儀器；Phomo型酶標儀，鄭州安圖實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1大豆親脂蛋白提取

大豆LP組分的分離由文獻[2]的方法經修改后使用。將大豆磨粉，過60目篩后使用正己烷進行脫脂，并在70℃干熱處理2 h，此時氮溶解指數降至75%，可有效防止LP與11S共沉淀。干熱處理后的脫脂豆粉按料液比8 g/mL加入到蒸餾水中，用NaOH調節pH值至8.0。在20℃下攪拌1 h后3 000g離心10 min。分離上清液并加入10 mmol/L Na2SO3,然后用H2SO4調節pH值至5.8，隨后3 000g離心10 min分離上清液，將上清液用H2SO4調節pH值至5.0，并在55℃下處理15 min。然后加入50 mmol/L NaCl并用NaOH調節pH值至5.5，3 000g離心10 min，沉淀即為LP組分，凍干備用。

1.3.2超聲處理

將4.8 g LP溶解在240 mL的磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L, pH值7.0)，在室溫(20℃)下攪拌2 h，制得質量濃度為20 mg/mL的大豆親脂蛋白溶液，將超聲處理器的鈦探頭(直徑0.636 cm)插入液面，進行超聲處理，本試驗選擇在20 Hz下，超聲功率為0、120、240、360、480 W，超聲時間為10、20 min，樣品編號見表1，每超聲處理4 s，間隔2 s。

表1 不同超聲處理樣品編號

1.3.3十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

根據文獻[8]的方法進行SDS-PAGE電泳試驗。分別配置12%的分離膠與5%的濃縮膠，將5%的2-巰基乙醇(2-ME)加入到樣品緩沖液中。將樣品和緩沖液的混合物在沸水中加熱5 min，用于電泳運行的緩沖液是0.025 mol/L Tris-HCl，0.192 mol/L甘氨酸和0.1%SDS，上樣量為10 μL，之后凝膠采用0.1%考馬斯亮藍(R-250)染色液(含45%甲醇和10%冰乙酸)染色30 min，并用脫色溶液洗滌脫色后分析。

1.3.4傅里葉紅外光譜(FITR)

將超聲處理后的大豆分離蛋白溶液進行凍干，凍干后的樣品置于干燥器中用P2O5充分干燥，取樣品1.5 mg，與200 mg溴化鉀研磨混勻后壓片進行紅外光譜測定。在試驗過程中，為了減少蒸汽的干擾，用干燥的N2持續注入測量室。測定時波數范圍為4000～400 cm-1，掃描次數為64次，分辨率4 cm-1，得到的紅外吸收曲線采用Peak fitting軟件和高斯曲線擬合，分析大豆親脂蛋白不同超聲功率下二級結構含量的變化[9]。

1.3.5內源熒光光譜

將 20 mg/mL大豆蛋白溶液用pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋到0.1 mg/mL，取一份稀釋液3 mL置于石英比色皿中掃描熒光圖譜。掃描條件為：記錄發射波長200～500 nm，激發波長設置為290 nm，增長間隔為10 nm。

1.3.6外源熒光強度

參照文獻[10]的方法稍作修改，采用ANS作為熒光探針測定蛋白質的外源熒光強度。分別稱取0.025 g不同品種蛋白樣品溶于50 mL 磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH值7.0)中，在室溫條件下攪拌1.0 h后離心(10 000g，30 min)，取上清液用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白質量濃度，并用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH值7.0)依次稀釋蛋白，使其質量濃度在0.005～0.1 mg/mL之間，將所得梯度的上清液溶液與8.0 mmol/L ANS以體積比100∶1混合，靜置3 min后測其熒光強度。激發波長390 nm，發射波長4 970 nm，夾縫為5 nm。以熒光強度對蛋白質質量濃度制圖，初始段斜率即為蛋白質分子的外源熒光強度。

1.3.7差示掃描量熱法(DSC)

參照文獻[11]的方法，用鋁制坩堝稱取3.0 mg(干基)樣品，按料液比6 mL/g加入去離子水，壓蓋密封后，置于室溫平衡后測定，差示掃描量熱法(DSC)測量使用Q1000型差示掃描量熱計以10℃/min的掃描速率在30～140℃范圍內進行。使用熱分析系統(TA-60WS)軟件測定變性峰的溫度。

1.3.8溶解性

參照文獻[12]的方法稍作修改測定大豆分離蛋白溶解性，用質量濃度約為10 mg/mL的蛋白質溶液(pH值8.0)，攪拌1 h使樣品溶解，靜置2 min后，將上清液倒入離心管中離心15 min(10 000g)。取上清液2 μL稀釋10倍，采用BCA法測定蛋白質質量濃度。以牛清蛋白為標準物，蛋白質溶解度為上清液中蛋白的質量濃度占樣品中總的蛋白質量濃度的百分比。

1.4 數據處理

本試驗數據均為3個平行樣的平均值，結果采用SPSS 22.0分析軟件和Origin 8.0軟件進行處理，采用ANOVA對數據進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果和討論

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳分析

圖1 不同超聲處理下LP的SDS-PAGE圖譜

不同超聲條件下LP的SDS-PAGE圖譜顯示如圖1(圖中M表示標準牛血清蛋白)所示，LP中包含7S和11S的亞基以及脂氧合酶、膜蛋白，34 ku蛋白存在于蛋白質的儲存液泡中，24、18、17 ku為來自油體蛋白[2-3,13]，LP中脂類質量分數為(7.48±0.049)%，較11S(2.36±0.026)%與7S(1.45±0.047)%高很多[3]，其脂質組分經薄層色譜分析顯示主要為磷脂，如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和磷脂酰肌醇[2]，而由于含有較高含量磷脂，因此膜蛋白對考馬斯亮藍具有較低的染色敏感性[3]，其電泳圖上條帶強度較7S、11S的亞基弱。而本研究旨在探明超聲處理對LP結構特性的影響，如圖1所示，與未超聲處理的LP相比，超聲處理后的LP亞基含量出現不同程度的改變，當超聲時間為10 min，超聲功率在120～360 W時，分子質量48 ku以上的亞基含量都明顯降低，這是因為超聲產生的空化效應破壞了大亞基結構；當超聲功率增加到480 W時，亞基含量整體降低，48 ku以上亞基條帶幾乎消失，這說明高強度超聲功率會引發LP亞基結構破碎和解離。結果表明，適當條件的超聲處理可有效保留LP亞基結構，并在此基礎上改善LP的物化性質。圖譜顯示超聲后亞基種類并沒有太大變化，表明超聲處理不會對LP的一級結構產生太大影響，與文獻[14-15]研究結果一致。

2.2 FITR分析

超聲處理后，LP的FITR光譜圖如圖2所示，波數從1 640 cm-1到1 650 cm-1變化時透光率增加，超聲處理的空化效應會導致β-轉角的展開，而無規則卷曲增加，使用傅里葉自反卷積(FSD)擬合和二階導數分析來實現最大頻帶變窄，降低信噪比并鑒定LP中存在的不同類型二級結構，之后采用楊氏方程計算LP的二級結構，結果如表2所示，超聲處理10 min時，隨超聲功率的增加α-螺旋減少，β-折疊先增加后減少，無規則卷曲增加，與超聲處理牛血清蛋白和乳清蛋白的結果一致[16-17]，而超聲處理20 min時，隨超聲功率的增加α-螺旋先增加后減少，β-折疊先增加后減少，再略有增加。此結果可能是由于超聲處理的空化效應使氣泡振蕩并破裂，從而產生坍塌壓力、湍流和剪切應力，影響了氨基酸的局部序列以及分子之間的相互作用并使β-轉角展開，無規則卷曲減少[18]。

圖2 不同超聲處理條件下LP的FITR光譜圖

表2 不同超聲處理下LP的二級結構相對含量

注：同列不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 內源熒光光譜分析

大豆蛋白所表現出的內源熒光強度主要是因其含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)[19]，激發波長為280 nm，主要依靠Trp和Tyr發射熒光[20]，Trp熒光強度較強是由于Tyr與Trp之間發生了能量轉移，而熒光的變化可反映色氨酸微環境的變化[21]，因此色氨酸的熒光峰可近似看作大豆蛋白的熒光峰，從而反映大豆蛋白的三級結構。由圖3可知，超聲處理后，LP的內源熒光強度均發生不同程度的增加，在超聲處理時間為10 min時，內源熒光強度隨著超聲功率的增加先增大后減小，并且最大波長(λmax)發生不同程度的紅移，可能由于超聲處理期間，LP分子通過水解解折疊，破壞其疏水作用[22]，Trp的微環境由疏水變為親水，一般情況下熒光波長會隨著溶劑極性的增大而紅移，內源熒光強度也會有所增加，因為在極性溶劑中π→π*躍遷所需的能差減小，躍遷概率增加。而超聲強度過大時會導致暴露于溶劑的生色團數量增加，從而導致內源熒光強度降低。

圖3 不同超聲處理下LP的內源熒光光譜

2.4 外源熒光強度分析

圖4 不同超聲處理下LP的外源熒光強度

外源熒光強度反映蛋白質分子表面上存在的疏水基團數量，文獻[19]研究認為疏水相互作用對蛋白質構象、功能和穩定性有重要影響。如圖4(圖中不同小寫字母表示差異顯著)所示，超聲10 min、功率為360 W以及超聲20 min、功率為240 W時外源熒光強度較強，并且功率較低時呈現遞增趨勢。超聲波處理會破壞蛋白質的非共價鍵引起蛋白質分子一定程度的展開，以及最初在蛋白質分子內的疏水基團暴露于外部環境，因此增加了疏水基團的數量[23]，而超聲強度較大時，外源熒光強度下降，超聲強度極強時可能導致LP聚集，疏水區封閉[24]，而持續增加超聲功率及時間，可能由于超聲波誘導蛋白質徹底變性，疏水殘基暴露，疏水性增加。本研究中，由圖4、5可看出，蛋白質的外源熒光強度越大溶解度越大，文獻[23-24]也得出此結果。

2.5 差示掃描量熱法

DSC的峰值溫度T2反映蛋白質結構的穩定性，焓變ΔH是引起蛋白質變性所需的能量，較高的焓值表示更有序穩定的蛋白質結構[25]，通過檢測不同超聲條件下LP熱變性溫度及其焓變，分析LP的熱穩定性，超聲處理后，LP的T2有所升高，360 W和240 W時的T2最高，提高了6～7℃，如表3所示。文獻[26-29]認為，由于超聲處理時產生的剪切力，導致分子間二硫化物和非共價鍵被破壞，并且游離巰基失活，有效減少了超聲過程中蛋白質的再聚集，當超聲功率過大時，LP的變性溫度下降，可以推測此時蛋白質分子結構被大量破壞。而LP經超聲處理后，焓值明顯下降，這可能與LP分子的展開有關，之后焓值隨超聲功率的增加而增加，可能與分子間疏水鍵部分重組有關[30]。因此，適度超聲可以提高LP的變性溫度，并且提高其結構穩定性。

圖5 不同超聲處理下LP的溶解性

表3 不同超聲處理下LP的DSC

2.6 溶解性

溶解性會促成或影響大多數蛋白質所表現出的功能性質，而LP由于含大量磷脂，相比7S、11S，其溶解性較差，圖5(圖中不同小寫字母表示差異顯著)顯示，超聲處理后，LP的溶解性得到了顯著改善，樣品D和G的溶解性最好，溶解度為41.1%和43.0%，提高了20個百分點左右。在超聲處理過程中發生的空化效應會產生大量的空化氣泡，這會增加周圍塌陷氣泡區域的局部溫度和壓力[31]，導致蛋白質的去折疊，構象改變，進而使其內部親水性氨基酸殘基暴露[32]，并且由于超聲處理期間促使蛋白中的不溶性沉淀物形成可溶性聚集體[33]，因此溶解性得到顯著提升。而與肽鍵的水解關系不大，因為超聲處理后LP的SDS-PAGE圖譜并無太大變化，此結果與文獻[23]的研究一致，由圖中樣品E、F、H可知，持續增加超聲功率及時間會導致再次溶解性降低，可能是由于不溶性聚集體的形成[34]。溶解性會影響大多數蛋白質的功能性質，因此有必要確定最佳的超聲功率及時間，為改善LP的理化性質及功能性質提供最佳的預處理條件。經試驗確定最佳超聲條件為：在360 W超聲功率下處理10 min。

3 結束語

超聲處理對LP的結構及溶解性具有相當大的影響，超聲處理后在電泳圖中分子量未發現明顯變化，亞基含量有所改變，經紅外、熒光光譜分析后發現，其二級、三級結構發生明顯變化。超聲處理后LP分子間的非共價鍵減少，分子解折疊，減少了蛋白質分子的再聚集，提高了其變性溫度及結構穩定性，而結構的改變導致功能性質改變。本研究中，超聲功率為360 W時處理10 min和超聲功率為240 W時處理20 min，對LP的溶解性及疏水作用的改善效果最佳，而繼續增加超聲功率及超聲時間，則會對LP的性能產生負面影響。這是由于過剩的能量導致蛋白質過度解折疊，大量疏水殘基暴露，重新形成了不溶性聚集體。經試驗確定最佳超聲條件為：在360 W超聲功率下處理10 min。