恩諾沙星在雪山雞不同組織中殘留消除規律研究

唐敏敏 朱磊 欒楓婷 邵雪梅 趙航 魏瑞成 王冉

摘要：為掌握恩諾沙星在雪山雞不同組織中的殘留消除規律，合理確定該品種肉雞的休藥期，以雪山雞為研究對象，以臨床推薦劑量混飲恩諾沙星水溶液，連續飲用5 d。分別于停藥后0.16、1、3、5、7、9、12 d 7個時間點取雞的肌肉、腎臟、肝臟和皮脂組織進行檢測。通過超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC-MS/MS）對凈化處理過的組織進行恩諾沙星及其代謝物環丙沙星測定，使用內標法定量。結果顯示，停藥后0.16 d恩諾沙星標志殘留物以肝臟組織最高，肌肉組織最低。實測數據采用WT1.4計算軟件擬合，腎臟組織的休藥期為2.93 d，肌肉組織的休藥期為 6.25 d，肝臟組織的休藥期為7.77 d，皮脂的休藥期為14.46 d。雪山雞按照推薦劑量飲水給藥，建議休藥期為15 d。

關鍵詞：恩諾沙星;液相色譜串聯質譜;消除規律;休藥期

中圖分類號：S859.84?文獻標志碼：A?文章編號：1002-1302（2020）21-0215-05

恩諾沙星為第三代喹諾酮類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌性強、生物利用度高、體內不易被代謝等優點，與其他抗生素聯用無交叉感染[1]，在禽類養殖中是喹諾酮類最優良的藥物之一。但喹諾酮類藥物的毒副作用也不容忽視，如會造成肝損傷、引發神經系統的不良影響等[2]。人類長期食用含低劑量喹諾酮類藥物的動物性食品，容易誘導耐藥性傳遞，從而影響該類藥物的臨床療效。黃羽肉雞是指除了國外培育的白羽肉雞外的所有有色羽肉雞[3]，是中國特色的肉雞產業。其中，雪山雞是利用我國優質地方良種藏雞和茶花雞雜交選育而成的品種[4]，肉質纖細順滑，味道鮮嫩可口，深受消費者的喜愛。目前，我國使用的肉雞抗菌藥物殘留限量是引用國際食品法典委員會（CAC）和部分發達國家的限量標準，存在不完全適用于我國地方雞種生產的現象，給我國黃羽肉雞產品質量安全帶來潛在風險。

目前，報道大多集中在恩諾沙星在畜禽動物中的藥物動力學研究[5-6]，也有學者研究了抗菌藥物在畜禽動物體內的殘留消除規律[7-8]，其中，禽類主要針對白羽雞，較少有對地方雞種的研究，基于此，本研究評估典型抗菌藥物（恩諾沙星、環丙沙星）在雪山雞不同組織中殘留消除規律，了解殘留消除時間，為制定黃羽肉雞中抗菌藥物的休藥期提供數據支撐，以期指導生產。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

恩諾沙星可溶性粉，購自南京杰科生物技術有限公司;恩諾沙星標準品（批號132847，純度99.00%），購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;環丙沙星鹽酸鹽（批號132903，純度92.19%），購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;恩諾沙星-D5內標標準品（批號272238，純度99.00%），購自Witega公司;環丙沙星-D8 內標標準品（批號281436，純度99.80%），購自Witega公司;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），購自美國霍尼韋爾公司。

1.2 儀器設備

SXIEX Triple Quad 4500 液相色譜串聯質譜儀（美國Sciex公司），分析天平（德國賽多利斯CPA225D），高速勻漿機（LAB PRECITION HM 6300），離心機（Eppendorf 5810R），氮吹儀，渦旋混合器。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗動物 試驗組選擇30日齡雪山雞品種64羽，大小一致，公母各半，期間不給任何抗菌藥物，于常州市立華牧業試驗場飼養至60～70日齡，隨后開始殘留代謝試驗。給藥組56羽，公母各半，對照組8羽，公雞4羽，母雞4羽。試驗前后各組飼養條件相同。

1.3.2 給藥與樣本采集 按照恩諾沙星可溶性粉推薦的給藥途徑和給藥方式，具體按照恩諾沙星計算，混飲，每1 L水100 mg藥量，自由飲水，連用 5 d。2019年8月25日分別從停藥開始的0.16、1、3、5、7、9、12 d屠宰取樣8羽（給藥組、公母各半）和1羽（空白對照組），分別采集雞胸肌肉、全肝、雙腎和皮脂樣品，做好標記，于-20 ℃保存。

1.3.3 測定方法 本研究采用國家推薦標準 GB/T 20366—2006（動物源產品中喹諾酮類殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法）[9]進行測定。

1.3.4 樣品前處理 稱取5 g試樣（精確至0.001 g），置50 mL離心管中，加入50 μL 1.0 μg/mL 混合內標工作溶液，加入20.0 mL 甲酸-乙腈[甲酸 ∶ 乙腈（體積比）=2 ∶ 98]，渦旋混合 1 min，4 000 r/min離心5 min，提取液轉移至另一50 mL離心管中，殘渣采用10.0 mL 酸化乙腈重復提取1次，合并提取液，備用。

在提取液中加入10 mL乙腈飽和的正己烷，振搖10 min。4 000 r/min離心5 min棄去正己烷層。乙腈層在50 C下氮吹儀吹至近干。用甲酸-乙腈溶液1.0 mL溶解，經0.22 μm濾膜過濾后作為試樣溶液，供LC-MS/MS測定。

1.3.5 液相色譜參考條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC@BEH C18色譜柱，粒徑1.7 μm，2.1 mm×100 mm。流動相（A）：0.1%甲酸，流動相（B）：0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫條件：0.0～1.0 min，3%B，1.1～6.0 min，B由20%升至45%，6.1～8.0 min，B保持95%，8.1 min B降為3%。

1.3.6 質譜參考條件 離子源：電噴霧（ESI）離子源;掃描方式：正離子;檢測方式：多反應離子監測（MRM）;離子化電壓（IS）：5 500 V，溫度（TEM）：500 ℃，噴霧器溫度（GS1）：60 psi，輔助加熱器（GS2）：60 psi;氣簾氣（CUR）：35 psi。定性、定量離子對、去簇電壓和碰撞能量見表1。

1.3.7 方法回收率和精密度 對照組樣品（未檢出恩諾沙星標志物殘留）的肌肉、肝、腎、皮脂樣品作為空白對照，分別做加標回收和精密度試驗，每個濃度設置3個平行樣品。

2 結果與分析

2.1 標準曲線和方法回收率

恩諾沙星、環丙沙星在1～50 ng/mL（內標濃度20 ng/mL）范圍內呈現良好線性關系，恩諾沙星線性方程為：y=0.176 87x-9.68×10-3，相關系數r為0.9 994，環丙沙星線性方程為y=0.04 9 24x-3.456×10-4，相關系數r為0.999 9。由恩諾沙星和環丙沙星標準溶液色譜圖（圖1）可知，恩諾沙星在胸肉中回收率為81.4%～115%;在腎臟中回收率為99.4%～122.1%;在肝臟中回收率為89.4%～94.9%;在皮脂中回收率為78.4%～95.4%。環丙沙星在胸肉中回收率為83.0%～105.0%，腎臟中回收率為94.3%～101.0%，肝臟中回收率為83.6%～109.1%，皮脂中回收率為82.1%～96.9%。相對標準偏差均小于15%。

2.2 雞肉各組織中藥物殘留及消除規律

恩諾沙星在動物組織中的殘留標志物為恩諾沙星及其代謝物環丙沙星的總量，在動物體內消除緩慢，半衰期長。采用內標法定量，對所采集的各組雞不同組織中（肌肉、腎臟、肝臟和皮脂）恩諾沙星（以恩諾沙星和環丙沙星之和計）進行檢測。不同時間點各殘留量及藥物殘留量均值見表2。由消除曲線（圖2）可知，在停藥后0.16 d，肝臟、腎臟、肌肉中的恩諾沙星及環丙沙星總殘留量達最大值，按照“平均值±標準差”計算，肝臟、腎臟、肌肉中恩諾沙星殘留標示物總量分別為（1 725±237.7）、（621.4±123.4）、（213.1±69.6） μg/kg，其殘留量隨著時間均呈下降趨勢，且前期以較快速率下降，腎臟和肌肉的殘留量在停藥1 d后已低于農業農村部公布的最大殘留限量MRL，肝臟殘留量在停藥 3 d 時低于農業農村部公布的最大殘留限量MRL。皮脂的代謝情況與上述3種組織略有區別?皮脂中恩諾沙星及環丙沙星之和在停藥1 d時達到最大值，殘留量為（956.1±108.0） μg/kg，隨后呈現緩慢下降的趨勢，這與張崇威等報道的結果[10]一致，直至停藥12 d才低于農業農村部公布的最大殘留限量MRL。各組織中殘留消除曲線表明，恩諾沙星及其代謝物在雪山雞的各組織中均有滯留，且主要代謝方式為肝臟和腎臟，1 d內雪山雞各組織中恩諾沙星代謝速率由快到慢依次為肝臟、腎臟、肌肉、皮脂。

2.3 休藥期計算

根據《食品安全國家標準（GB 31650—2019） 食品中獸藥最大殘留限量》規定，恩諾沙星作為廣譜殺菌藥物，殘留標志物為恩諾沙星和環丙沙星之和;其中，規定家禽肌肉、皮脂中最大殘留不超過100 μg/kg、家禽肝組織中最大殘留不超過 200 μg/kg，腎組織中不超過300 μg/kg，采用CVMP制定的統計方法（雙單側95%置信區間），對恩諾沙星可溶性粉在雞組織中休藥期進行計算[11]。恩諾沙星在各組織中的殘留消除擬合情況見圖3。根據WT1.4軟件計算出恩諾沙星腎臟組織的休藥期為2.93 d，肌肉組織的休藥期為6.25 d，肝臟組織的休藥期為7.77 d，皮脂的休藥期為14.46 d。

3 討論

3.1 檢測方法

目前，恩諾沙星和環丙沙星的檢測方法主要有高效液相色譜法[12-13]、高效液相色譜-串聯質譜法[14-15]，另一些新型快檢技術也迅速發展，如膠體金免疫層析法[16]、微流控芯片-質譜法[17]等。由于質譜檢測器具有高靈敏度優點，可對物質的組成和結構進行定性檢測，將其與液相色譜聯用，不僅可對目標物進行良好分離，并且可以彌補液相色譜不能對物質定性的缺點。因此，本研究采用國家標準推薦的液相色譜-串聯質譜的檢測方法，同時考慮到樣品基質對質譜的離子抑制影響，采用內標法校正，從而提高準確性，保證試驗數據的可靠性[18]。

3.2 休藥期

蔣志偉等通過推薦劑量飲水給藥，研究恩諾沙星可溶性粉在黃羽肉雞體內的殘留消除規律發現，乳酸恩諾沙星可溶性粉在肌肉、肝臟和腎臟的休藥期分別約為7.689、7.339、4.529 d[19]。吳波等研究了恩諾沙星在黃羽肉雞肌肉、肝、腎中殘留消除規律[20]，但均缺少對皮脂消除規律的研究，因此對休藥期的建議不夠完善。本研究結合雪山雞不同組織中殘留消除數據，通過休藥期軟件得到恩諾沙星在腎臟組織的休藥期為2.93 d，肌肉組織的休藥期為6.25 d，肝臟組織的休藥期為7.77 d，皮脂的休藥期為14.46 d，因此推薦休藥期為15 d。中華人民共和國農業部公告第278號規定，恩諾沙星在肉雞中的休藥期為8 d。本研究試驗雞品種為雪山雞，一般90 d左右出欄，其生長周期相對較長，屬于慢速生長品種，與其他肉雞品種相比，藥物代謝速度較慢，而皮脂在規定8 d內未達到安全標準，因此，針對該品種，在獸醫臨床上使用恩諾沙星存在安全風險，休藥期需要在15 d以上，以確保肉雞可食組織的恩諾沙星標志殘留物低于國家最高限量標準。

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