感染鯉皰疹病毒2型對異育銀鯽腸道菌群結構的影響

袁銳 方蘋 劉訓猛 陳靜 吳亞鋒 王晶晶 張仁展 劉肖漢

摘要：為探究異育銀鯽感染鯉皰疹病毒 2 型（Cyprinid herpesvirus 2，Cyhv-2）后對腸道菌群結構的影響，以人工注射方式使試驗異育銀鯽感染 Cyhv-2，采用16S rRNA基因高通量測序分析對試驗異育銀鯽腸道菌群的組成和多樣性進行了研究。結果顯示，感染組鯽魚腸道菌群 Alpha 多樣性及均勻度均低于對照組鯽魚;感染組與對照組鯽魚腸道菌群也產生了明顯的區別，兩者共有的優勢菌屬僅有2種（鯨桿菌屬和假單胞菌屬），其中感染組的優勢菌屬還包括Bacteroides（擬桿菌屬）、Aeromonas（氣單胞菌屬）、Vibrio（弧菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）這樣的致病菌屬，而對照組中鯽魚腸道優勢菌群未見上述病原菌屬，表明 Cyhv-2 感染可改變鯽魚腸道原有微生態。本研究為感染 Cyhv-2 鯽魚腸道微生物與宿主的相互影響提供了很好的參考，為鯽魚造血器官壞死病的防控提供了科學依據。

關鍵詞：鯉皰疹病毒 2 型;異育銀鯽;腸道菌群

中圖分類號：S941.4?文獻標志碼：A?文章編號：1002-1302（2020）21-0196-06

已有研究表明，動物腸道內生活著大量而復雜的微生物，包括真核微生物、細菌、古細菌和病毒等[1-2]，在演變和適應過程中逐漸形成了腸道菌群，作為生物體“被遺忘的器官”在生命活動中發揮著重要的作用，它們含有的基因也被稱為生物體的“第二基因組”[3]。近年來，腸道菌群與宿主健康的關系已成為研究熱點，魚類作為一種水生動物，受環境影響和作用，其腸道內亦進化出與所處環境相適應的正常菌群[4]，它們在調節宿主生理生化反應、促進消化吸收、介導宿主免疫應答和抵御宿主疾病發生等方面發揮著重要的作用，而腸道中的有益菌群可分泌多糖、脂類、維生素、相關活性酶類等一系列代謝產物，共同促進了免疫系統的作用[5]。

魚腸道內棲息著大量的正常菌群，它們覆蓋在腸道表面黏膜上，形成一道天然拮抗致病菌入侵的機械屏障，同時刺激機體產生非特異性和特異性免疫反應，與宿主共同維持內穩態的平衡，加強對機體的免疫保護[6]。有研究表明，腸道菌群與宿主間的復雜相互作用始于宿主出生之后，Sugita 等研究發現，羅非魚Oreochromis mossambicus仔魚在孵出 20～60 d 后，腸道內開始有菌群定殖。魚類腸道菌群的數量和組成，與種類、生長與棲息環境、是否投餌、投飼策略、腸道菌群的數量和組成，這些因素既統一又相互作用[7]。有研究表明，李學梅等采用PCR- DGGE指紋技術研究了斑點叉尾、銀鯽和異育銀鯽腸道微生物群落，結果發現，在斑點叉尾腸道中檢測到的菌群主要是變形桿菌門，而銀鯽和異育銀鯽腸道中菌群主要包括梭桿菌門中的類群，還包括變形桿菌門中的氣單胞菌，及一些未知的類群[8]。

鯽魚（Carassius auratus）作為我國重要的淡水養殖魚類，在江蘇、湖北等地養殖產量極高，根據2018年中國漁業統計年鑒顯示，僅2017年，全國養殖產量就達282萬t，產值高達100億元。然而，近年來，鯉皰疹病毒 2 型（CyHV-2）感染引起的鯽魚造血器官壞死病[9]嚴重危害鯽魚養殖業的健康發展，僅2012年就導致江蘇省異育銀鯽發病面積 3萬hm2，發病區域死亡率極高，造成嚴重的經濟損失。目前，有關鯽魚腸道菌群的研究局限于復合微生態制劑對異育銀鯽腸道菌群的影響[10]，以及健康鯽魚腸道菌群的分析[11-12]，關于鯉皰疹病毒2型感染對于鯽魚腸道菌群的影響研究還未見報道。對此，本研究運用高通量測序，對健康鯽魚和人工感染 CyHV-2 鯽魚腸道菌群進行了比較研究，以期為該病的防治提供腸道微生物方面的依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗鯽魚（體質量80～100 g/尾）來自江蘇江都淥洋湖水產養殖場，采樣前1個月轉移至江蘇省水生動物疫病預防控制中心室內養殖循環系統，水溫控制在22～26 ℃，期間投喂高蛋白鯽魚人工配合飼料。馴化3周后選擇規格相同的鯽魚隨機分成病毒感染組和對照組。病毒感染組鯽魚通過肌肉注射病魚組織勻漿液（組織勻漿液需用0.22 μm 濾膜過濾除菌），對照組鯽魚則通過肌肉注射無菌生理鹽水（同樣要用0.22 μm 濾膜過濾除菌）作對照處理。試驗4 d后，病毒感染組出現明顯癥狀，經分子生物學鑒定，確已感染 CyHV-2。隨機取 3 尾感染組鯽魚和健康組鯽魚進行后續分析。腸道菌群樣品取整個腸道用來提取菌群 DNA，樣品的具體采集和處理方法參照文獻[13]進行。

1.2 病毒感染組分子生物學鑒定

病毒感染組 CyHV-2 分子生物學檢測參照國標《金魚造血器官壞死病毒檢測方法》（GB/T 36194—2018）中推薦的檢測流程和技術參數進行。參照生工生物工程（上海）股份有限公司病毒核酸提取試劑盒說明書提取病毒基因組DNA。以提取的病毒 DNA 為模板進行 PCR 擴增，分別擴增 DNA 聚合酶基因（362 bp）和解旋酶基因（366 bp）。反應體系如下：Premix TaqTM 25 μL，上下游引物各1 μL（濃度為10 μmol/L），DNA模板為2.5 μL，加 ddH2O 20.5 μL，總反應體系為50 μL;PCR反應程序如下：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 變性1 min，55 ℃（聚合酶基因）或60 ℃（解旋酶基因）退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，35個循環;72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取擴增產物經瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進行檢測與分析。

1.3 鯽魚腸道菌群16S rRNA基因高通量測序分析

樣品腸道組織用無菌的剪刀剪碎后，放入2 mL離心管中，加入適量鋼珠和800 μL SLX，在破碎儀上進行破碎后提取（具體提取步驟參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說明書，見附錄一），提取好后的DNA用瓊脂糖凝膠方法檢測其完整性。利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應應加入的DNA量進行2輪擴增。第一輪擴增步驟如下：30 μL反應體系中包含2×Taq master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F（10 μmol/L） 1 μL，Primer R （10 μmol/L） 1 μL，模板DNA 2 μL（20 ng），H2O 11 μL;第一輪PCR擴增程序如下：94 ℃ 3 min，后接5個循環（94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s），再接20個循環（94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s），之后72 ℃ 5 min。第二輪擴增用第一輪擴增產物作為模板，其余條件一樣，程序如下：95 ℃ 3 min，后接5個循環 （94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s），之后 72 ℃ 5 min，PCR結束后，PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測回收。對于細菌和古菌擴增的PCR產物和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產物，選用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）處理回收。對于真菌PCR產物和其他擴增片段<400 bp的PCR產物，選用0.8倍的磁珠處理回收。利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以方便按照1 ∶ 1的等量混合后測序，等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。定量后，使用MiSeq測序平臺進行測序，所得到DNA序列分析進行分析，并通過RDP（Ribosomal Database Project）數據庫進行比對和OTU分類。

1.4 數據分析

分析過程使用R語言環境和PAST 2.0軟件，其中，R語言使用了Vegan、VennDiagram、ggplot 2和 ggfority 程序包。進行的主要分析包括：OUT 聚類分析;Alpha 多樣性分析，計算ACE、Chao、Shannon、Simpson、Coverage等物種多樣性指數，并制作所有樣品ACE、Chao、Shannon、Simpson、Richness指數的箱形圖;根據各樣本在 OTU 的分布情況繪制韋恩圖;樣本間菌群豐度差異分析。

2 結果與分析

2.1 PCR 檢測結果

病毒感染組的鯽魚樣品在攻毒試驗后1周內相繼發病，呈現典型的鯽魚造血器官壞死病癥狀，表現為鰓出血，體表尤其是鰭條基部出血紅腫，而對照組鯽魚健康，無明顯癥狀;取病魚的鰓、腎、脾、肝等組織提取病毒基因組進行 PCR檢測，獲得了片段大小分別為366 bp 和 362 bp 的特異性條帶（圖1），結果均呈 Cyhv-2 陽性。

2.2 腸道菌群 OTU 聚類分析

對感染組和對照組各樣本的腸道菌群進行基于 Bray-Curtis 方法的 OTU 樣本聚類，由圖2可知，樹枝的長度代表樣本間的距離，越相似的樣本會越靠近，圖中同一顏色的樹枝表示來源于同一組，對照組（H）和感染組（D）的3個樣本分別聚在了一起，說明感染 CyHV-2 后的鯽魚腸道菌群 OTU 豐度與對照組相比，出現了明顯的分化。

OTU 分布韋恩圖可以用來統計樣本中共有的和獨有的 OTU 數目，直觀地展現出環境樣品的 OUT 數目及重疊情況，感染組和對照組的鯽魚腸道菌群 OTU 分布韋恩圖（圖3）表明，感染組與對照組的共有 OTU 數目僅為 12 個，對照組3個樣本的 OTU 數達到 929 個，而感染組3個樣本的 OTU 數僅 541 個，相比對照組減少了 388 個，表明感染 Cyhv-2 后的鯽魚腸道菌群 OTU 豐度明顯降低。

2.3 腸道菌群 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性是對樣品物種多樣性的分析，基于 OTU 結果計算樣品的Alpha 多樣性指數，包括估算樣品 OTU 數量的 Chao 指數和 ACE 指數以及樣品微生物多樣性的辛普森指數、香農指數。由圖4可知，每個盒代表1個分組下面所有樣本的 Alpha 指數（分別是Chao指數、ACE指數、香農多樣性指數、辛普森多樣性指數），可以直觀地發現每組樣本下的多樣性指數情況，盒子越窄說明該組內相關多樣性指數越低，越寬則說明多樣性指數越高。腸道菌群 Alpha 多樣性分析結果表明，感染組的 Chao 指數、ACE 指數、辛普森指數、香農指數均低于對照組（圖4），其中，Chao 指數、ACE指數達到顯著差異水平（t-test，P<0.05），說明 CyHV-2 感染使鯽魚腸道菌群的豐度、多樣性、均勻度都明顯降低。

2.4 腸道菌群組成及相對豐度分析

首先比較了感染組與對照組鯽魚腸道微生物在門水平上的組成及相對豐度。結果表明，無論感染組還是對照組，均檢測到 23 個菌門（圖5），分別為變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、糖化細菌門（Candidatus Saccharibacteria）、衣原體門（Chlamydiae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、廣古菌門（Euryarchaeota）、酸酐菌門（Acidobacteria）、螺旋菌門（Spirochchaetes）、互養菌門（Synergistetes）、藍細菌門（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、懶桿菌門（Ignavibacterla）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、綠菌門（Chlorobi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、Parcubacteria。其中，感染組的優勢菌門（圖6）為變形菌門（52.06%）、梭桿菌門（31.52%）、擬桿菌門（11.15%）、放線菌門（2.77%），4個優勢菌門在感染組鯽魚腸道菌群中所占比例為97.5%;對照組的優勢菌門（圖7）為變形菌門（77.88%）、梭桿菌門（15.03%）、浮霉菌門（2.72%）、放線菌門（1.87%），4個優勢菌門在對照組鯽魚腸道菌群中所占比例為97.5%。

將屬水平上主要菌群進行分析（表1）發現，感染組鯽魚腸道菌群優勢菌屬有 8 種，分別是鯨桿菌屬（31.39%）、假單胞菌屬（22.33%）、擬桿菌屬（10.85%）、氣單胞菌屬（9.72%）、希瓦氏菌屬（7.55%）、弧菌屬（5.56%）、短波單胞菌屬（1.4%）、鞘氨醇單胞菌（1.33%）;對照組鯽魚腸道菌群優勢菌群則有10種，分別是檸檬酸桿菌屬（23.91%）、芽殖桿菌屬（21.28%）、鯨桿菌屬（15.03%）、包西氏菌屬（11.78%）、根瘤菌屬（4.66%）、不動桿菌屬（3.49%）、假單胞菌屬（3.18%）、水球菌屬（1.58%）、艾克曼菌屬（1.24%）、紅桿菌屬（1.18%）。將感染組與對照組優勢菌屬對比發現，感染組的鯽魚腸道優勢菌群發生明顯變化，兩者共有的優勢菌屬僅有2種（鯨桿菌屬和假單胞菌屬），相對豐度相比對照組也都有所下降。除了共有優勢菌屬外，感染組和對照組各有 6 種或 8 種獨有優勢菌種，其中感染組的優勢菌屬還包括擬桿菌屬、氣單胞菌屬、弧菌屬、希瓦氏菌屬這樣的致病菌屬，而對照組中鯽魚腸道優勢菌群未見上述病原菌屬。分析認為，感染鯉皰疹病毒 2 型對鯽魚腸道菌群產生了較為明顯的影響，一些常見的腸道菌群被病原菌所取代。

3 討論

魚類腸道微生物菌群與宿主的免疫等密切相關，有研究表明，魚腸道表面黏膜上覆蓋著大量的正常菌群，從而形成一道天然抵御致病菌侵入的機械屏障[14]。另有研究發現，魚類腸道菌群的變化與免疫機能的改變有著密切的聯系，李莉等研究表明，隨著草魚腸道中氣單胞菌屬細菌比例下降而腸桿菌科細菌含量上升時，草魚白細胞的吞噬百分比和吞噬指數明顯上升，說明草魚腸道優勢菌群的變化可能與增強白細胞吞噬活性有關[4]。因此，維持魚類腸道正常菌群的動態平衡對宿主生命活動至關重要。

影響腸道菌群組成的因素有很多，水環境、投喂飼料、轉基因的應用乃至病原的感染均能對魚類腸道菌群產生顯著影響。涂宗財等研究了水環境中重金屬銅對異育銀鯽腸道微生物的影響，受到重金屬脅迫處理后的異育銀鯽腸道微生物多樣性明顯降低[15];宦海琳等研究了復合微生態制劑對異育銀鯽腸道菌群的影響，證實在飼料中添加適量的復合微生態制劑可有效改善異育銀鯽腸道微生態平衡，有益于消化酶的分泌和營養吸收[10];饒劉瑜等對轉基因鯉魚與對照鯉腸道微生物群落差異進行了研究，結果表明，在3個不同的發育時期，轉基因組鯉魚腸道微生物群落組成與對照組鯉魚相比發生了明顯改變[16];朱文根等研究了感染草魚呼腸孤病毒對腸道菌群多樣性的影響，證實 GCRV 的感染可使草魚腸道微生態發生紊亂，群落豐度與多樣性等均明顯下降[17];李東亮等用嗜水氣單胞菌感染草魚發現，草魚腸道微生物菌群多樣性及優勢菌群均發生了明顯變化[18]。

雖然已有研究表明，病原感染可引起水生動物腸道菌群紊亂，但是 Cyhv-2 的感染對鯽魚腸道菌群的影響尚不清楚。本研究應用高通量測序技術研究了 Cyhv-2 感染對鯽魚腸道菌群的影響，結果表明 Cyhv-2 的感染使得鯽魚腸道微生物群落結構產生顯著變化，Cyhv-2 感染組鯽魚腸道菌群 Alpha 多樣性顯著低于對照組鯽魚，優勢菌屬亦發生明顯變化，病原菌明顯增多，說明感染 Cyhv-2 使得鯽魚腸道微生態系統發生了紊亂。

已有研究表明，變形菌門是魚類腸道微生物中最主要類群之一[19]，本研究結果顯示，無論是感染組還是對照組，變形菌門均是鯽魚腸道最優勢菌門。研究發現，感染組異育銀鯽腸道中隸屬于變形菌門的氣單胞菌屬和弧菌屬與對照組相比，其豐度呈上升趨勢，由于氣單胞菌屬中的致病性氣單胞菌以及弧菌屬中的副溶血性弧菌均為魚類的主要致病菌，因此氣單胞菌和弧菌屬的數量上升，提示感染 Cyhv-2 后，異育銀鯽體內存在混合細菌感染的潛在風險，這為異育銀鯽的病毒細菌混合感染提供了理論依據，對于感染 Cyhv-2 后的異育銀鯽養殖綜合防控提供了理論支撐。

本研究表明，Cyhv-2 的感染會引起異育銀鯽腸道正常菌群紊亂。腸道優勢菌群的改變往往會加劇魚體免疫力下降，進而加重腸道微生態失衡，導致致病菌過度增殖，從而使鯽魚遭受細菌激發感染。因此，如果能夠在易發病水溫來臨前，投喂一些易于在異育銀鯽腸道定殖的有益微生態制劑，或許可以穩定鯽魚腸道菌群，從而緩解鯽魚的病毒細菌混合感染，為緩解鯽魚造血器官壞死病提供幫助。

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