細菌對廢棄羽毛的降解及在可持續農業中應用

王琳 魏啟舜 周影 張培 郭成寶

摘要：羽毛質量約占雞總質量的5%～7%，已成為家禽屠宰的主要廢棄物。羽毛中90%以上的成分為角蛋白，可作為多肽、氨基酸類有機肥來源。利用傳統理化方法降解羽毛能耗大，且可造成氨基酸結構破壞。相比之下，利用角蛋白降解細菌降解羽毛高效節能、反應條件溫和，具有廣闊的市場前景。本文著重介紹角蛋白降解細菌種類、產酶特點以及角蛋白降解機制，角蛋白降解產物及降解細菌對植物具有抗病促生作用，廢棄羽毛的生物降解及肥料化利用可促進有機農業發展、改善農業生態系統和提高土壤生物活性。

關鍵詞：生物肥料;羽毛角蛋白;角蛋白降解菌;有機肥料

中圖分類號：X172;X713?文獻標志碼：A?文章編號：1002-1302（2020）21-0040-06

我國目前已成為世界上第二大家禽生產國，2018年我國家禽出欄量達到130億只，根據推算產生的干羽毛量約為130萬t，其中江蘇省家禽出欄量達6.420 1億只，產生的干羽毛量約為6.4萬t，為避免禽流感等病害危害人們健康，全國已基本實現家禽的集中屠宰，屠宰產生的以羽毛為主的角蛋白類廢棄物產量越來越大，目前只有少量優質的羽毛被服裝、工藝品等行業利用，或者經理化方法處理后添加到飼料中，大多數羽毛均被廢棄，而角蛋白在自然環境下降解緩慢，有時甚至造成局部的環境污染。角蛋白被認為是一種除了纖維素和幾丁質外第三大蘊藏豐富高分子化合物的資源[1]。羽毛角蛋白含量達到90%左右，還包含鉀、鈣、鎂、鐵、鋅、銅等礦物質，是很好的蛋白質與氨基酸來源。

角蛋白有多種存在形式，包括蹄甲、魚鱗、角、動物皮毛等，由于角蛋白結構中含有較多的二硫鍵且高度交聯，結構非常穩定，不易在環境中降解，成為固體廢物管理的一部分。傳統的角蛋白處理工藝包括高溫、高壓和酸堿水解等，這不僅能耗大，成本高，會對環境造成二次污染，而且還會破壞部分氨基酸，從而影響角蛋白的利用率。利用產角蛋白酶的微生物或角蛋白酶對富含角蛋白的有機廢棄物進行降解是一種效率高、成本低和環境友好的方式，通過生物轉化羽毛廢棄物形成的營養均衡易消化物質中含有氨基酸、多肽和銨離子，既可以作為動物飼料又能作為生物肥料原料。細菌產生的角蛋白酶已經在皮革工業中有了一定應用，利用產角蛋白酶的細菌對角蛋白廢棄物進行降解在有機肥料產業中具有相當大的應用潛力。

1 細菌角蛋白酶特點

角蛋白是一種機械強度高、化學性質穩定、不溶性的硬質蛋白，根據二級結構的不同，可分為α-角蛋白和β-角蛋白。α-角蛋白是由具有螺旋構象的多肽鏈構成的纖維狀蛋白[1-2]，其亞基間的氨基酸序列由富含α螺旋的中央棒狀區和兩側的非螺旋區構成，亞基之間形成大量的二硫鍵;β-角蛋白由反向平行的β-折疊片以平行的方式堆積而成[2]。由于內部具有高度交聯的二硫鍵、氫鍵，且分子間具有相互疏水作用，角蛋白很難被一般蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等所降解[3]。

角蛋白酶是一種特殊的蛋白酶，它能夠降解羽毛、蹄甲、毛發、羊毛等難溶的硬質角蛋白。這類酶對角蛋白具有較高的底物特異性。很多微生物包括細菌、真菌、放線菌都能產生角蛋白酶。產角蛋白酶的微生物廣泛存在于自然界中，目前國內外已經分離篩選到很多能降解角蛋白的菌株，已報道的具有降解角蛋白能力的細菌主要來源于芽孢桿菌屬，如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）和蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）[4-7]，還有革蘭氏陰性菌如嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）[8];已報道的能降解角蛋白的放線菌主要屬于馬杜拉放線菌屬（Actinomadura sp. ）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）[9-10]。

Lin等最早從地衣芽孢桿菌中純化到屬于S8蛋白酶家族的角蛋白酶[11]。早期對角蛋白酶的研究發現，大多數角蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶中的枯草桿菌蛋白酶，主要來源于芽孢桿菌屬和放線菌屬微生物[12]。后來也有一些金屬蛋白酶中的角蛋白酶被陸續發現。來源于金黃桿菌（Chryseobacterium sp. ） kr6的角蛋白酶Q1被鑒定屬于M14金屬蛋白酶家族[13]。來源于鏈霉菌（Streptomyces sp.） 594[14]、溶桿菌（Lysobacter sp.）NCIMB 9497[15]、金黃桿菌（Chryseobacterium sp.） [16]、枯草芽孢桿菌（B. subtilis） MTCC 9102 [17]、微桿菌（Microbacterium sp.） kr10[18]和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[19]的金屬蛋白酶也能降解角蛋白，這些金屬蛋白酶對金屬抑制劑乙二酸四乙酸（EDTA）敏感。

角蛋白酶的特性取決于產酶微生物。大多數角蛋白酶都為胞外酶，一般為堿性或中性酶，最適反應pH值為7.5～9.0，但也有少數角蛋白酶具有極強的耐堿性[20]，部分角蛋白酶在酸性條件下具有酶解活性[17]。有些角蛋白酶有著較寬的最適反應pH值范圍，巨大芽孢桿菌（Bacillus megatherium）的角蛋白酶在pH值為7～11時都具有角蛋白酶活性，但在pH值為7～8之間活性最高[21]。 芽孢桿菌比如枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌的角蛋白酶最適反應溫度為40～50 ℃，最適pH值為5～9[22]。嗜麥芽寡養單胞菌的角蛋白酶最適反應溫度為60 ℃，最適pH值為10[23]。不同微生物來源的角蛋白酶最適反應溫度差異較大，有些細菌角蛋白酶的耐熱性較好，最適反應溫度在40～70 ℃之間，比如微白黃鏈霉菌（Streptomyces albidoflavus）、熱紫鏈霉菌（Streptomyces thermoviolaceus）和Streptomyces gulbargensis[24-26];閃爍桿菌（Fervidobacterium pennavorans） 的角蛋白酶最適反應溫度為80 ℃[27];高溫菌F. islandicum AW-1的角蛋白酶最適反應溫度達到100 ℃[28]。

羽毛水解液可以促進種子發芽率的提高和作物生長。盆栽條件下澆施羽毛生物降解液的處理，小白菜的葉片SPAD值、株高、地上部分生物量均顯著高于CK處理，葉片SPAD值顯著大于澆施三元素水溶復合肥（FH）的處理，株高、地上部分生物量和氮肥利用率與FH處理沒有顯著差異[37]。Paul等研究表明，羽毛水解液能夠促進孟加拉鷹嘴豆的出芽和生長，添加羽毛水解液的處理側根數與根瘤菌數量是其他處理的3倍，主要是由于羽毛水解液的施用增加了土壤中可直接利用的氨基酸或營養物質濃度，促進了根表面積的提高，更有利于固氮菌在根部附著、入侵和生長，從而促進根瘤的形成[49]。

施加羽毛水解液可以增加土壤中的有益菌群數量，Paul等認為，施加羽毛水解液的處理相比空白對照土壤中固氮菌和溶磷細菌的數量分別增加了1.9倍和5.8倍[49]，與Rai等的研究結果[51]一致。土壤中加入含有角蛋白降解細菌的羽毛水解液后，有益菌群數量顯著增加[42]，但過量添加則會減少有益菌群的數量，可能是因為高濃度的NaCl會對土壤中土著微生物產生毒性[49-50]。

4 農業方面其他應用

利用角蛋白降解細菌降解羽毛釋放游離氨基酸的工藝在制藥、飼料、可生物降解膜制作、制膠行業均可應用[12，40，52-53]。羽毛是一種很好的氨基酸來源。不同的菌降解羽毛后獲得的氨基酸組分有所差異（表1）[54-55]。羽毛粉經過微生物酶解之后營養特性提高，更利于動物吸收[56-57]。羽毛降解后產物中的營養組成類似于大豆蛋白。地衣芽孢桿菌已經在工業中被用于生產商業角蛋白酶。在含有羽毛的堆肥中添加角蛋白降解菌可起到除臭的作用，同時還能產生抗生素，抑制病原菌的產生[58]。

5 總結

目前，我國農田尤其是集約化農業區，化肥過量投入現象十分普遍。過量化肥投入并未帶來作物產量的同步提升，化肥（尤其是氮肥）過量施用引發了一系列環境問題，如溫室氣體排放量增加、水體富營養化等。來自家禽業的羽毛廢棄物是很好的氮碳來源，利用角蛋白降解細菌將廢棄羽毛轉化為含氨基酸的肥料，替代化肥提高農作物產量和品質，有利于農業的可持續發展。

利用角蛋白降解菌降解羽毛形成一種優質的有機肥料在農業中應用，既能促進植物生長、提高作物品質，還能起到生物防治作用，是一種非常經濟、環境友好的有機廢棄物利用方式。利用微生物降解羽毛的產物作為肥料，既能提供有利于植物生長的大量元素C、N及微量元素，同時還產生促進植物細胞分裂的植物生長激素IAA。有的角蛋白降解菌不僅具有降解羽毛的作用，同時也是一種植物益生菌，通過分泌蛋白酶抑制病原菌生長，起到生物防治的作用。因此利用角蛋白降解菌降解羽毛廢棄物生產的生物有機肥料，對于農田生態、環境保護、人類健康、土壤生物活性維持起著重要作用，有利于有機農業的可持續發展。

參考文獻：

[1]Mckittrick J，Chen P Y，Bodde S G，et al. The structure，functions，and mechanical properties of keratin[J]. JOM，2012，64（4）：449-468.

[2]Meyers M A，Chen P Y，Lin A Y，et al. Biological materials：structure and mechanical properties[J]. Progress in Materials Science，2008，53（1）：1-206.

[3]賈如琰，何玉鳳，王榮民，等. 角蛋白的分子構成、提取及應用[J]. 化學通報，2008（1）：1-6.

[4]劉柏宏，張 娟，堵國成，等. 地衣芽孢桿菌來源角蛋白酶N端對活力及其熱穩定性的影響[J]. 微生物學通報，2014，41（8）：1491-1497.

[5]Rajput R，Tiwary E，Sharma R，et al. Swapping of pro-sequences between keratinases of Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus：altered substrate specificity and thermostability[J]. Enzyme and Microbial Technology，2012，51（3）：131-138.

[6]Abdel-Naby M A，El-Refai H A，Mohammad H I. Structural characterization，catalytic，kinetic and thermodynamic properties of keratinase from Bacillus pumilus FH9[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2017，105（1）：973-980.

[7]E Silva L A D，Macedo A J，Termignoni C . Production of keratinase by Bacillus subtilis S14[J]. Annals of Microbiology，2014，64（4）：1-9.

[8]Zhen F，Juan Z，Liu B H，et al. Cloning，heterologous expression and characterization of two keratinases from Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1[J]. Process Biochemistry，2014，49（4）：647-654.

[9]Habbeche A，Saoudi B，Jaouadi B，et al. Purification and biochemical characterization of a detergent-stable keratinase from a newly thermophilic actinomycete Actinomadura keratinilytica strain Cpt29 isolated from poultry compost[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2014，117（4）：413-421.

[10]Xie F，Chao Y，Yang X，et al. Purification and characterization of four keratinases produced by Streptomyces sp. strain 16 in native human foot skin medium[J]. Bioresource Technology，2010，101（1）：344-350.

[11]Lin X，Lee C G，Casale E S，et al. Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain[J]. Applied and Environmental Microbiology，1992，58（10）：3271-3275.

[12]Brandelli A，Daroit D J，Riffel A. Biochemical features of microbial keratinases and their production and applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，85（6）：1735-1750.

[13]Riffel A，Brandelli A，Bellato C D，et al. Purification and characterization of a keratinolytic metalloprotease from Chryseobacterium sp. kr6[J]. Journal of Biotechnology，2007，128（3）：693-703.

[14]Azeredo L I，Lima M B，Coelho R R，et al. Thermophilic protease production by Streptomyces sp. 594 in submerged and solid-state fermentations using feather meal[J]. Journal of Applied Microbiology，2006，100（4）：641-647.

[15]Wang S L，Wan-Ting H，Tzu-Wen L，et al. Purification and characterization of three novel keratinolytic metalloproteases produced by Chryseobacterium indologenes TKU014 in a shrimp shell powder medium[J]. Bioresource Technology，2008，99（13）：5679-5686.

[16]Silveira S T，Gemelli S，Segalin J，et al. Immobilization of keratinolytic metalloprotease from Chryseobacterium sp. strain kr6 on glutaraldehyde-activated chitosan[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2012，22（6）：818-825.

[17]Balaji S，Kumar M S，Karthikeyan R，et al. Purification and characterization of an extracellular keratinase from a hornmeal-degrading Bacillus subtilis MTCC （9102）[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24（11）：2741-2745.

[18]Thys R S，Brandelli A. Purification and properties of a keratinolytic metalloprotease from Microbacterium sp.[J]. Journal of Applied Microbiology，2006，101（6）：1259-1268.

[19]Lin H H，Yin L J，Jiang S T. Expression and purification of Pseudomonas aeruginosa keratinase in Bacillus subtilis DB104 expression system[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（17）：7779-7784.

[20]Shinji M，Ichikawa M，Oka T，et al. Molecular characterization of a keratinolytic enzyme from an alkaliphilic Nocardiopsis sp. TOA-1[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，34（5）：482-489.

[37]魏啟舜，趙荷娟，周 影，等. 施用羽毛生物降解液對白菜生長和基質養分的影響[J]. 江蘇農業科學，2019，47（20）：156-159.

[38]魏啟舜，趙荷娟，郭成寶，等. 羽毛生物降解氨基酸肥對草莓生長和果實品質的影響[J]. 中國農學通報，2019，35（32）：46-52.

[39]Nagarajan S，Eswaran P，Masilamani R P，et al. Chicken feather compost to promote the plant growth activity by using keratinolytic bacteria[J]. Waste and Biomass Valorization，2018，9（4）：531-538.

[40]Jin-Ha J，Lee O M，Young-Dong J，et al. Production of keratinolytic enzyme by a newly isolated feather-degrading Stenotrophomonas maltophilia that produces plant growth-promoting activity[J]. Process Biochemistry，2010，45（10）：1738-1745.

[41]Kshetri P，Roy S S，Sharma S K，et al. Transforming chicken feather waste into feather protein hydrolysate using a newly isolated multifaceted keratinolytic bacterium Chryseobacterium sediminis RCM-SSR-7[J]. Waste and Biomass Valorization，2019，10（1）：1-11.

[42]Bhange K，Chaturvedi V，Bhatt R. Ameliorating effects of chicken feathers in plant growth promotion activity by a keratinolytic strain of Bacillus subtilis PF1[J]. Bioresources and Bioprocessing，2016，3（1）：13.

[43]Khan M S，Zaidi A，Wani P A. Role of phosphate-solubilizing microorganisms in sustainable agriculture-A review[J]. Agronomy for Sustainable Development，2007，27（1）：29-43.

[44]張艾明.磷在農田土壤中的遷移轉化規律及其對農業環境的影響[C]//組學大數據整合生物信息學研討會論文集，2017.

[45]Rodriguez H，Gonzalez T，Goire I，et al. Gluconic acid production and phosphate solubilization by the plant growth-promoting bacterium Azospirillum spp[J]. Die Naturwissenschaften，2004，91（11）：552-555.

[46]Kaur G，Reddy M S. Influence of P-solubilizing bacteria on crop yield and soil fertility at multilocational sites[J]. European Journal of Soil Biology，2014，61：35-40.

[47]Sudhir K R，Mukherjee A K. Optimization for production of liquid nitrogen fertilizer from the degradation of chicken feather by iron-oxide （Fe3O4） magnetic nanoparticles coupled β-keratinase[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2015，4（4）：632-644.

[48]Teale W D，Paponov I A，Palme K. Auxin in action：signalling，transport and the control of plant growth and development[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology，2006，7（11）：847-859.

[49]Paul T，Halder S K，Das A，et al. Exploitation of chicken feather waste as a plant growth promoting agent using keratinase producing novel isolate Paenibacillus woosongensis TKB2[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2013，2（1）：50-57.

[50]Asik B B，Turan M A，Celik H，et al. Effects of humic substances on plant growth and mineral nutrients uptake of wheat （Triticum durum cv. Salihli） under conditions of salinity[J]. Asian Journal of Crop Science，2009，1（2）：87-95.