ImageJ軟件在醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域中的應(yīng)用研究現(xiàn)況＊

黎 晨，尤培蒙，皮啟星，王晨曦，何俊霞，肖文媛，拜思瓊，趙 晉

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

圖像分析在許多生命科學(xué)領(lǐng)域，特別是醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域方面是非常重要的。一組好的數(shù)據(jù)是得到一個滿意的實驗結(jié)果的必要組成部分。目前，數(shù)據(jù)圖像的數(shù)量正呈指數(shù)級增長，且圖像的視覺檢測和人工測量是一項耗時的任務(wù)，缺乏靈敏度、準(zhǔn)確性、客觀性和可重復(fù)性[1]。所以，為了避免人為的選擇偏倚和測量偏倚，提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性與實驗的客觀性，研究人員迫切需要某種軟件來提供自動或半自動的成像技術(shù)。

ImageJ是一款由Bethesda，MD于美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）研發(fā)的基于Java的公共免費圖像處理和分析程序[2]，可運行于Windows、Mac OS和Linux系統(tǒng)，其本身可以對圖像進(jìn)行像素焦點計數(shù)和大小定義，并正確的計數(shù)重合焦點，還能測量每個單獨焦點的綜合光密度（IOD），且支持圖像棧功能，即在一個窗口里以多線程的形式層疊多個圖像，并行處理等等功能決定了ImageJ軟件可進(jìn)行細(xì)胞焦點計數(shù)分析、面積百分比的比較與測定、3D圖像特征量化分析、細(xì)胞和生物體共定位、組織形態(tài)分析、血管相關(guān)密度分析等圖像量化分析功能。ImageJ作為一個開源軟件，擁有大量免費插件[4]，它可以被自由地檢查、修改和重新開發(fā)[5]，不但可提高圖像分辨率與清晰度，還可根據(jù)需要功能安裝相應(yīng)的插件。用戶亦可利用Java平臺進(jìn)行編程用來開發(fā)目前缺少的適用插件，來滿足當(dāng)前需要的功能。由于該軟件具備的強大功能，所以ImageJ軟件廣泛應(yīng)用于國外的醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域與其他研究領(lǐng)域中。

1 應(yīng)用領(lǐng)域

1.1 細(xì)胞焦點計數(shù)與分析

為了評估冷凍消融前后的T細(xì)胞浸潤情況，Cerqueira MA等[6]使用ImageJ軟件進(jìn)行CD4+/CD8+比值的定量分析，并可比較Diag+、Diag-、Cryo+和Cryo-之間的差異。除細(xì)胞外，Bera T等[7]用ImageJ與傳統(tǒng)技術(shù)如光密度、流式細(xì)胞技術(shù)和qPCR進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)該軟件可根據(jù)不同微生物的進(jìn)行定制，以估計不同的病原體。該方法還可以檢測～100細(xì)菌cfu/mL或通過增加成像和計算時間估計更低的濃度。

1.2 面積與面積百分比

使用ImageJ比較緊張和松弛狀態(tài)下的肛提肌擴(kuò)張容積，測量提上瞼裂孔(LH)和泌尿生殖道裂孔(UGH)和矢狀面中部面積，結(jié)合t檢驗、效應(yīng)大小和Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行測量比較顯示該結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義[3]。Abou Eitta RS等[8]用ImageJ測量采用兩種方式治療痤瘡疤痕后顯示瘢痕面積百分比明顯下降，結(jié)果表明兩只治療方法均有效，但兩種治療方法療效差異并不顯著。

1.3 3D圖像特征量化分析

對3D圖像的測定與分析一直是醫(yī)學(xué)研究中的一大難題，一方面不能確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，另一方面數(shù)據(jù)的不完整性都是是需要克服的問題。Erguvan等[9]在ImageJ中研發(fā)了一個宏SurfCut用于提取表皮細(xì)胞輪廓信號，允許從3D共聚焦堆棧中提取細(xì)胞輪廓。其次，通過ImageJ軟件自帶的3D圖像分析功能，Ayuso-Montero R[10]通過對口腔3D表面掃描進(jìn)行咬合接觸面（OCA）評估，與T掃描相比較，通過組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）評定，發(fā)現(xiàn)相較于3D掃描，T掃描測量OCA的方法更為可靠。“DiAna”：一個ImageJ附加程序[11]，可自動對對象進(jìn)行協(xié)同定位和距離分析并提供對物體之間的協(xié)同定位的深入分析，檢索3D測量包括共同定位體積和接觸表面。

1.4 蛋白定位與共定位

蛋白定位分析大多來自于多通道、高分辨率、熒光顯微圖像且常為大量數(shù)據(jù)。ImageJ則提供了簡單、可定制和可重現(xiàn)的多通量化分析的方法[12]。Escorcia W等[13]將軟件應(yīng)用于活細(xì)胞成像技術(shù)，并根據(jù)數(shù)據(jù)分析評估了蛋白質(zhì)運動、定位、穩(wěn)定性和計時以及核動力學(xué)和染色體分離，將其結(jié)果與普通顯微鏡方法進(jìn)行比較。軟件里包含的“Coli-Inspector”功能支持自動和交互方法的組合，是可以完全控制圖像分析和數(shù)據(jù)收集的方法，并使用目視檢查工具快速消除偽影。能根據(jù)細(xì)胞分裂周期、細(xì)胞年齡對細(xì)胞進(jìn)行分類，并分析每個蛋白的空間定位模式[14]。

1.5 組織形態(tài)分析

組織學(xué)研究的主要部分是使用高分辨率成像進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和分析，使用ImageJ是從高分辨率橫斷面圖像測量皮質(zhì)骨區(qū)域的半自動方法[15]。Shukla S等[16]建立小鼠角膜損傷模型，通過ImageJ計算評分角膜混濁程度，評估了不同的給藥方式(局部，結(jié)膜下，腹腔內(nèi)和靜脈注射)促進(jìn)組織修復(fù)和恢復(fù)角膜透明性的效果。

1.6 血管相關(guān)密度分析

光學(xué)相干斷層血管造影（OCT-A）用于評估血管與微血管的變化情況，ImageJ可用于測量不同OCT-A掃描的糖尿病患者血管與灌注密度改變，根據(jù)結(jié)果比較哪種掃描方式更具代表性[17]以及評價濾過手術(shù)前后結(jié)膜血管生成的變化，進(jìn)行濾過性手術(shù)的成功程度相關(guān)性分析[18]。

1.7 ImageJ與其他工具軟件結(jié)合比較

1.7.1 ImageJ與Photoshop

通過灰度直方圖分析，使用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICCs)和測量的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)來評價和比較Photoshop和ImageJ用于老年人肌肉組織回聲的可靠性[19]。結(jié)果顯示兩款軟件的結(jié)果無明顯差異，但與Photoshop和ImageJ一起使用的ROI選擇方法更適用于老年人組織回聲的采集后圖像分析。McKenzie等[20]將ImageJ與Photoshop結(jié)合進(jìn)行了母雞卵泡尿囊膜(HET-CAM)試驗，通過檢測對微小血管的損傷量化新型凝膠制劑的刺激性潛力，結(jié)果表明該藥物對眼組織無刺激性。在橫斷面研究里，Lim HW等[21]測量下斜肌過度活動的程度，用Photoshop對圖像進(jìn)行處理，ImageJ進(jìn)行分析結(jié)合相關(guān)系數(shù)的計算與回歸評估，得出結(jié)果1級、2級、3級和4級的下斜肌過度動作的平均角度分別為 10.5±9.1°、16.8±7.8°、24.3±8.8°和 40.0±12.2°(P<0.001)。

1.7.2 ImageJ與Slice-O-Matic

Irving BA等用此兩款軟件分析了腹部脂肪組織的橫截面積。Bland-Altman分析表明[22]ImageJ與Slice-O-Matic的結(jié)果具有可比性。測量間的變異系數(shù)分別為0.9%～4.8%和0.2%～2.6%，獲得的aVF橫截面積之間平均差異的95%置信區(qū)間為(-5.7，+10.8 cm)。提示該兩款軟件并無明顯差異，其結(jié)果都提供了對脂肪組織和骨骼肌橫截面積的可靠測量并具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 插件

2.1 軟件研究現(xiàn)況

在新興科學(xué)的需求下對ImageJ的發(fā)展提出了相應(yīng)的挑戰(zhàn)。很多實驗結(jié)果的分析應(yīng)用原生的ImageJ已經(jīng)不足以滿足實驗的需求，這迫使研究人員們另辟新徑，不斷改進(jìn)和完善ImageJ的生態(tài)系統(tǒng)和功能。于是，為了滿足各種不同實驗要求的各式插件也就相繼而生。不過并不是所有的插件都是可用于實驗結(jié)果的分析，下面結(jié)合了各大搜索引擎（中國知網(wǎng)、萬方、PubMed、GeenMedical、SCI（科學(xué)引文索引）數(shù)據(jù)庫）的檢索結(jié)果后，簡單羅列了幾個目前功能相對完善，結(jié)果分析較準(zhǔn)確的ImageJ插件。

2.2 相關(guān)插件

2.2.1 Custom Macros

“Custom Macros”插件自動和系統(tǒng)化了神經(jīng)組織圖像分析中的用戶交互功能，包括區(qū)域選擇和閾值、點/對象計數(shù)、面積測量、批量過濾處理和數(shù)據(jù)審查。在進(jìn)行多個神經(jīng)化學(xué)探針的神經(jīng)組織成像實驗和覆蓋不同腦區(qū)的實驗時可用于分析和處理數(shù)百張顯微圖像組成的結(jié)果數(shù)據(jù)集[23]。

2.2.2 AxonTracer

脊髓組織切片中軸突的數(shù)量級靠人工計數(shù)難以量化分析，于是Patel A等[24]開發(fā)了一款名為“AxonTracer”的插件，旨在彌補ImageJ在量化計數(shù)軸突時的不足，用于自動分析受損神經(jīng)系統(tǒng)中再生的軸突。該插件可根據(jù)免疫組織學(xué)染色識別移植細(xì)胞、移植物或其他陽性區(qū)域(ROI)，并對ROI內(nèi)的再生軸突進(jìn)行跟蹤量化。

2.2.3 Cell Concentration Calculator(CCC)與Transwell Counter

在用ImageJ計數(shù)細(xì)胞時，有時可因為圖像上的色差，雜質(zhì)和板塊等異物以及背景顏色的影響而產(chǎn)生不同程度上結(jié)果的偏差[25]。“CCC”與“Transwell Counter”結(jié)合使用可在最小背景下獲取高質(zhì)量縮微圖，用于快速計數(shù)和分析大樣本大小，內(nèi)置分析工具幫助校準(zhǔn)計數(shù)。前者用于圖像體積校正，后者用于圖像采集與平場。此插件僅適用于自動血細(xì)胞分析儀(或已知體積)和遷移/侵襲細(xì)胞計數(shù)[26]。然而由于細(xì)胞計數(shù)時的不可控因素太多，再好的插件也只能降低偏差的發(fā)生，不能做到完全準(zhǔn)確的程度。所以在計數(shù)細(xì)胞時，圖像的飽和度、對比度、亮度、增益、平均銳度仍需要憑借經(jīng)驗來滿足最佳計數(shù)條件。

2.2.4 SarcOptiM

SarcOptiM包括一個心肌細(xì)胞收縮的模擬器和視頻發(fā)生器用來采集參數(shù)。可以實時或離線工作，后者能克服旋轉(zhuǎn)運動或與位移相關(guān)的偽影[27]，如對ImageJ中捕獲或顯示的視頻幀進(jìn)行傅里葉變換分析來計算肉瘤長度，從而允許實時或離線測量肉瘤長度[28]。此插件主要用來測量肌節(jié)長度，評估心肌細(xì)胞的收縮功能。

2.2.5 QuantIF

為了定量測定病毒感染的免疫熒光蛋白表達(dá)，Handala L等[29]開發(fā)了一個 ImageJ宏插件“QuantIF”，使用DAPI和Specific-染色法自動確定來自同一場的兩個圖像的細(xì)胞總數(shù)和標(biāo)記細(xì)胞數(shù)，可自動分析數(shù)個圖像，每幅圖約需一秒。

2.2.6 NucleusJ

該插件專門用于在3D中表征核形態(tài)和染色質(zhì)組織。從圖像堆棧開始，將Otsu分割方法與核球度優(yōu)化相結(jié)合，確定核邊界。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域通過使用3D分水嶺算法分割細(xì)胞核并通過在結(jié)果區(qū)域上閾值對比度測量來分割。輸出時，NucleusJ量化了15個參數(shù)，包括核的形狀和大小以及核內(nèi)物體及其在核內(nèi)的位置[30]。

3 結(jié)語

ImageJ軟件雖然功能強大，應(yīng)用范圍廣，但想要得到期望的結(jié)果必須是在正確使用該軟件及其插件作為前提。在確保軟件操作規(guī)范后，ImageJ軟件的量化數(shù)據(jù)既可作為終點指標(biāo)直接對結(jié)果進(jìn)行說明與判定，也可當(dāng)作中間指標(biāo)作為后續(xù)分析檢驗的數(shù)據(jù)來源，亦或是作為輔助數(shù)據(jù)，從側(cè)面襯托最終結(jié)果的可靠性與可信度。值得提出的是，使用ImageJ軟件分析都有一個共同點，就是其結(jié)果必須進(jìn)行檢驗或回歸分析等，并判斷有無臨床意義，因為此軟件的應(yīng)用僅為客觀的量化數(shù)據(jù)分析結(jié)果，最大限度上避免了人工分析或計數(shù)檢測的主觀性對實驗造成的偏差，也就是說，ImageJ軟件提供了一個對實驗進(jìn)行的測定分析的平臺，其得出的數(shù)據(jù)可靠性還需做后續(xù)檢驗，進(jìn)行比較，來確定測定數(shù)據(jù)的可用性程度。

ImageJ軟件仍有許多已知和未知的功能，或是經(jīng)過驗證或是仍處于驗證階段，國內(nèi)的研究人員對結(jié)果的測量可以傾向于對該軟件的驗證與開發(fā)，從而加快實驗進(jìn)程、提高實驗科學(xué)性、為臨床科研提供參考。