水產品糖蛋白的分離分析研究進展*

顧 盼，翟子揚，祁艷霞，趙前程

(大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116000)

海洋是生命的故鄉，不僅有豐富的水資源，而且蘊藏著寶貴的能源[1]，中國有黃海、渤海、東海、南海四大海域，海域遼闊，水產品種類豐富，有巨大地開發利用潛力，前景廣闊。我國是水產品養殖大國，2017年水產品全年出口量達433.94萬噸，出口額211.50億美元，同比分別增長2.40%和1.99%[2]。水產品養殖種類豐富，其中貝類養殖產量占養殖總產量的80%，是海洋養殖業的重要組成部分[3]。水產品不僅營養豐富味道鮮美，而且還具有多種生理功能，如抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力和抗氧化等[4-5]。這些生理功能與水產品中的糖蛋白有著密切的關系。因此，本文回顧了近年來水產品糖蛋白的研究進展，以期為水產品糖蛋白結構和功能的研究提供參考依據。

糖蛋白(glycoprotein)是體內重要的生物大分子，是由短的寡糖鏈與蛋白質共價相連構成的一種結合蛋白質，在大多數情況下，糖含量低于蛋白質含量，并且糖鏈作為綴合蛋白質的輔基，廣泛存在于生物體中[6]，蛋白質糖基化是最重要的翻譯后修飾之一，對于蛋白質的折疊、構象穩定和活性等方面具有重要影響[7]。目前，隨著基因組學技術的發展，有研究預測生物體內有50%以上的蛋白質發生了糖基化[8]。糖蛋白同時具有糖和蛋白質的性質，大多可溶于水、稀酸、稀堿和鹽溶液中，但要注意在提取過程中必須保證糖蛋白分子的完整性，防止過酸、過堿、高溫以及劇烈的機械作用等對糖蛋白分子的破壞，使其失去活性。

1 糖蛋白的提取

1.1 鹽溶液浸提法

糖蛋白在稀鹽和緩沖鹽溶液中具有良好的穩定性和溶解度性，通常將氯化鈉溶液做浸提液，這主要因為溶液中存在的鹽離子可以與蛋白質結合起到保護作用，蛋白質不易變性便于提取。劉淑集等[9]以翡翠貽貝為原料，確定最佳提取條件為氯化鈉濃度0.2 mol/L，料液比1:1，提取時間61 min，提取溫度62 ℃，該條件下糖蛋白的提取率為51.55%。范秀萍等[10]從珠母貝全臟器中進行糖蛋白分離，結果表明最佳分離提取條件為：浸提劑為濃度1.0 mol/L的NaCl溶液，料液比為1:10，65 ℃下浸提60 min，此時珠母貝糖蛋白得率為3.37%。戴宏杰[11]以虎斑烏賊為研究對象，確定了最佳提取條件：氯化鈉濃度3.8 mol/L，料液比1:20，提取時間1.5 h，提取溫度66 ℃，虎斑烏賊肌肉糖蛋白提取率為7.87%。章建設等[12]以魷魚內臟為原料，確定提取工藝為：NaCl溶液濃度為3%，料液比為1:6、浸提時間為60 min、浸提溫度為80 ℃，此條件下糖蛋白得率最高。李雨哲等[13]從馬氏珍珠貝中進行糖蛋白的提取，確定其最佳提取條件：pH 7.2的1.0 mol/L的NaCl溶液，料液比1:2進行冰浴，4 ℃下離心過濾得到糖蛋白提取液。何曉梅等[14]以三角帆蚌臟器為原料，以0.3 mol/L NaC1溶液為提取溶劑，浸提溫度4 ℃、料液比1:15、浸提時間9 h，此條件下糖蛋白得率大于3%。

1.2 水浸提法

由于糖鏈的多羥基結構具有高度親水性，糖蛋白或糖肽在水中極易溶解，所以可采用水來提取各種糖蛋白或糖肽。該方法操作簡便，根據糖蛋白的來源和性質不同提取條件也略有差異。黃來珍等[15]對近江牡蠣采用料液比1:4，水浸提時間120 min，溫度4 ℃，高速離心取上清液超濾濃縮，得到糖蛋白，其中總糖含量1.19%，可溶性蛋白含量2.18%。范秀萍等[16]以波紋巴非蛤為研究對象，水作浸提劑提取糖蛋白，提取條件為：料水比為1:10，浸提溫度80 ℃，浸提時間60 min，60 ℃條件下旋轉蒸發濃縮。馮曉梅等[17]對牡蠣采用料水比1:1低溫提取，水浸提時間120 min，溫度4 ℃，離心后凍干得到糖蛋白粗提物。郁迪等[18]以菲律賓蛤仔肉為原料，料液比1:3，90 ℃浸提，第一次浸提4 h，第二次浸提3 h，兩次浸提溶液混合醇沉并冷凍干燥得粗提物，純化后得到糖蛋白。夏光華等[19]以鯽魚卵為原料，采用水浸提的方法提取糖蛋白，料水比1:1浸提30 min，高速離心取上清液加入等體積的90%苯酚溶液攪拌2～3 h，二次離心得到粗糖蛋白。

2 糖蛋白的富集

水產品是復雜的生物體系，糖蛋白豐度低，而且后續的檢測中容易受到其他非糖基化蛋白質的干擾，所以對糖蛋白進行分離富集，去除干擾組分，對后續糖蛋白的分析檢測具有十分重要的意義。

2.1 凝集素親和層析法

凝集素親和層析法是將凝集素以共價形式與不溶性載體相連接作為親和吸附劑的層析技術。適用于從混合物中分離或分析多糖、糖蛋白、細胞膜碎片、酶、抗體復合物等糖類及糖復合物。凝集素是一類糖結合蛋白，能特異性識別并結合單糖或聚糖結構中特定的序列，它們與糖鏈的結合既是非共價又是可逆的，因此在凝集素捕獲糖蛋白或糖肽后，可以通過特定的單糖與凝集素的競爭性結合將糖蛋白或糖肽洗脫下來。主要分成一種凝集素、多種凝集素或連續凝集素親和層析三種方法，一種凝集素親和方法操作簡單但相對的僅能富集特定的糖蛋白或糖肽，多種凝集素法可以富集較復雜的糖蛋白，實驗技術相對成熟、操作簡單、重復性好。凝集素親和法應用靈活多樣，植物凝集素最為常見如：刀豆素A、麥胚素、花生凝集素和大豆凝集素等。Wang[20]結合了多種凝集素的特異性，發展了一種包含刀豆凝集素，麥芽凝集素和木菠蘿凝集素三種凝集素的富集檢測血清中蛋白的策略，該技術已成功應用于人血清的蛋白質分析，并且發現了人類血清的蛋白質都是糖基化的。Liu等[21]以氧化葡聚糖作為間隔物促進合成了硅基材料伴刀豆球蛋白凝集素，并證實了該凝集素親和富集糖蛋白和糖肽具有良好的效果。劉玲[22]以鰱魚Ⅳ期卵為原料提取到半胱氨酸蛋白酶抑制劑粗提液，純化分級得到具有較高活性的組分，該活性部分經刀豆凝集素Sepharose 4B親和層析富集純化后確定其為糖蛋白。

2.2 酰肼化學法

酰肼化學法是利用糖蛋白或糖肽上糖鏈的順式鄰二羥基結構與高碘酸反應生成醛，醛基可以特異性地與酰肼樹脂上的氨基反應形成共價鍵，從而被酰肼樹脂捕獲，并利用PNGase F酶或胰蛋白酶將糖肽從酰肼樹脂上釋放，得到富集后的糖基化肽段。酰肼化學反應特異性高有助于糖基化位點的確認，并且洗脫過程中蛋白質損失小，但該方法反應步驟多操作復雜，且條件難以控制。Zhang等[23]對人血清中的質膜蛋白利用酰肼化學法進行分析鑒定和定量糖肽。Sudhir等[24]采用酰肼法從人支氣管上皮細胞富集糖蛋白，并采用液相色譜-質譜聯用分析，在人支氣管上皮細胞中鑒定到了317個N-連接糖蛋白含608個N-連接糖基化位點。

酰肼法和凝集素富集法是糖蛋白富集應用較廣泛的兩種技術，有報道認為兩種方法互補使用可以提高糖基化位點的鑒定數目，但也有研究表明兩種方法并未顯示出顯著的互補性。雖然酰肼法的糖肽富集效率較凝集素富集法高，但是凝集素法鑒定到的糖蛋白和糖基化位點數目卻較酰肼法高[25]。

2.3 親水相互作用色譜法

由于糖鏈的多羥基結構具有高度親水性，因此許多親水性的層析介質可以用于糖蛋白或糖肽的富集，如纖維素[26]和瓊脂糖[27]。該方法可以富集各種類糖肽，操作簡便，但是不可避免的會有非特異性吸附，不能有效區分不同類型的糖肽或者糖蛋白，從而影響后續分析的準確性[28]。葉志國[29]以菲律賓蛤仔全臟器為研究對象進行糖蛋白的提取，粗糖蛋白經DEAE-52纖維素、Sephadex-G100柱層析分離純化，得到中性糖蛋白GP-1和酸性糖蛋白GP-2二個主要組分。秦玉青[30]從雌性扇貝生殖腺脫脂后提取糖蛋白，經DEAE-纖維素柱鹽析、透析、Sephadex-G100純化及冷凍干燥后，得到中性糖蛋白(FNGP)和酸性糖蛋白(FAGP)。近年來，基于親水材料的萃取技術得到了一定的發展，在瓊脂糖、多聚酰胺等傳統材料的基礎上[31-32]，又出現了兩性離子-親水作用色譜材料[33]和基于點擊化學的親水作用色譜填料[34]，顯著增加了親水作用色譜對糖基化肽段富集的特異性和富集倍數，促進了親水作用色譜在蛋白質糖基化位點規?；治鲋械膽?。此外，結合質譜分析，親水作用材料能夠用于完整的糖基化肽段鑒定和定量[35-36]，親水作用色譜在糖基化蛋白質組學分析中具有重要的價值。

2.4 硼酸親和層析法

硼酸親和技術是利用硼酸基團與糖肽中糖鏈上的順式二羥基的可逆反應形成環狀二酯，并且通過這種共價配位作用實現目標物的分離和純化。在堿性條件下，硼酸基團可與順式二羥基結構相互作用形成穩定的五元環絡合物，分子被介質吸附；在酸性條件下絡合的部分被打開，分子從介質上解吸。硼酸親和層析法可以用于分離純化帶有順式二羥基結構的化合物，例如：糖蛋白、核苷、核苷酸、糖類等。該方法操作簡單只需改變pH值，優化后可以洗脫非特異性吸附，專一性和普適性強[37]。Ren等[38]使用親水性的交聯劑通過原位聚合反應以制備了親水性的硼親和整體柱，該硼親和整體柱被成功的用于糖蛋白的富集。Luo等[39]用氨基苯硼酸修飾二維單層氧化石墨烯后結合卵清蛋白，經溶膠—凝膠法在其表面包覆一層有機硅，去除模板蛋白后得到了對卵清蛋白有雙重識別能力的硼親和印跡材料，其結合位點同時具有硼親和配基以及與卵清蛋白結構相匹配的形狀，能排除糖蛋白卵鐵傳遞蛋白的干擾，從雞蛋清中特異性選擇富集卵清蛋白，極大地提高了硼親和材料的選擇性。

3 糖蛋白的結構性質分析

3.1 傳統分析方法

傳統分析方法主要針對純化的單一組分的糖蛋白。確定一種物質的結構主要有以下幾點：分子量大小、單糖組成、α-、β-異構體、環狀結構及糖苷鍵類型等情況。根據寡糖鏈和蛋白質連接類型的不同，可分為N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化以及糖基磷脂酰肌醇錨糖基化(GPI-Anchor)四種連接形式[40]，其中N-糖基化、O-糖基化兩種連接形式最為常見。對于提取到的糖蛋白傳統分析方法主要從糖蛋白的等電點測定、氣相色譜法、紅外光譜分析、β-消除反應和紫外光譜分析等幾方面進行。糖蛋白可分為酸性糖蛋白和堿性糖蛋白，酸堿性可通過其等電點的pH值來確定，糖蛋白糖鏈的單糖組成可通過氣相色譜技術進行鑒定。紅外光譜分析可以測定糖蛋白環狀結構的類型、異頭異構體，紅外吸收峰的位置與強度反映了分子結構上的特點，可用于識別物質的結構組成或確定其化學基團，而吸收譜帶的吸收強度與化學基團的含量有關。β-消除反應主要用來確定糖蛋白的糖苷鍵類型，N-糖苷鍵和O-糖苷鍵這兩種最為常見，前者對堿穩定，后者易被堿打開[41]。O-糖苷鍵被堿打開后，在糖肽連接處若為絲氨酸即轉變成α-氨基丙烯酸，若為蘇氨酸，則轉變成為α-氨基丁烯酸，二者均在240 nm下具有特征性紫外吸收[42]。

馮曉梅[17]對從青島牡蠣提取到的糖蛋白組分F22進行相關性質的研究，結果表明F22是酸性糖蛋白，等電點為pH 5.5，紅外光譜分析顯示具有酰胺鍵特征吸收峰，F22的中性單糖是由葡萄糖這一種單糖組成的同多糖，由15種氨基酸所組成，其中纈氨酸在總氨基酸中占比最大，相對含量達到37.7%；其次為甘氨酸，其相對含量達到了10%以上，該糖蛋白是β-折疊結構，糖苷鍵類型為吡喃型，糖肽鍵類型為N-糖肽鍵。徐明生等[43]從河蜆中提取到糖蛋白，經鑒定該糖蛋白相對分子量19030 D，存在O-糖肽鍵，具有多糖的特征吸收，含有吡喃糖β-型糖苷鍵。包郁明[44-45]針對皺紋盤鮑臟器提取得到的糖蛋白進行系統的結構分析，結果表明該糖蛋白含有8種單糖，17種氨基酸，同時鑒定到該糖蛋白是β-折疊結構，糖苷鍵類型為吡喃型，糖肽鍵類型為O-糖肽鍵。遲長鳳等[46]以貽貝為原料提取糖蛋白，通過分析表明貽貝糖蛋白的分子量約為16.9 kDa，含有O-糖苷鍵和N-糖苷鍵，糖和蛋白含量分別為23.54%和76.46%，由15種氨基酸組成，單糖的組成比例為D-葡萄糖:L-阿拉伯糖:D-半乳糖:D-果糖:D-甘露糖=1.00:2.01:6.93:7.27:4.05。陳銀[47]以黑魚魚卵為原料提取糖蛋白，經鑒定黑魚糖蛋白含有N-糖苷鍵和O-糖苷鍵，單糖組成為甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1.20:1.00:12.22。徐永健等[48]以大海馬為原料提取粗糖蛋白，經純化分級得到2個組分HG-11和HG-21，HG-11有15種氨基酸，HG-21有16種氨基酸，兩組分中的單糖有甘露糖、核糖、葡萄糖和半乳糖四種，鑒定到該糖蛋白是通過O-糖苷鍵連接的并且具有α螺旋結構，糖苷鍵是α型吡喃糖。

3.2 蛋白質組學分析方法

對于復雜生物體系中提取富集出來的的混合糖蛋白，采用蛋白質組學技術可以對其有較好的分析能力，蛋白質的糖基化位點可以通過蛋白質組學的方法來確定，目前蛋白質組學的新技術包括雙向凝膠電泳[49]、蛋白質芯片[50]、酵母雙雜交、同位素標記親和標簽(isotope coded affinity tags，ICAT)和液相色譜—質譜聯用技術[51]。雙向凝膠電泳該技術是分析和檢測來自復雜生物蛋白質的有力工具，根據等電點和分子量的不同來分離蛋白質[52-53]。蛋白質芯片是一種蛋白質組檢測技術，具有高度并行性、高通量、微型化和自動化的特點，可用于檢測混合物中單個蛋白質與他們相對應的識別物間的相互作用[54]。液相色譜-質譜(High performance liquid chromatography -mass spectrometry，HPLC-MS)聯用技術基本原理是先采用液相色譜將不同的糖肽進行分離，然后進入質譜。在質譜中首先將樣品離子化帶上電荷，然后帶電粒子經加速電場的作用，形成離子束并進入質量分析器，在質量分析器中，電場或磁場可以在空間或時間上對不同質荷比的離子進行分離，或是透過過濾的方式，將它們分別聚焦到檢測器上，從而獲得質量與濃度(或分壓)相關的圖譜，最后是數據庫檢索，即將質譜所得的實際圖譜與肽段碎裂產生的理論圖譜進行對比以確定肽段序列及其歸屬的蛋白質[55]，HPLC-MS技術因其操作簡單準確度高的特點成功地用于糖肽或糖蛋白的結構分析[56-57]。

糖蛋白質組學研究主要包括定性和定量兩個方面，定性主要是對于蛋白質的確定、糖基化位點的鑒定，以及完整的糖鏈信息三方面進行解析，其中糖基化位點的鑒定在糖蛋白解析中顯得至關重要，因為完整糖基化肽的二級譜圖非常復雜，所以不能直接搜索數據庫[58]。目前最常見最成熟的方法是通過內切糖苷酶切除糖鏈并在糖基化位點引入一定質量差異，將PNGase F作用在氨基酸與五糖核心中第一個GlcNAc之間，酶切后使得糖基化位點的天冬酰胺(AsnN，114.043 Da)轉變為天冬氨酸(AspD，115.027 Da)造成相對分子量增加0.98 Da，從而起到糖基化位點質量標簽的作用被質譜檢測到[59-60]。定量主要是對于生物樣本中糖基化程度進行相對或絕對定量，相對定量又分為非標定量和標記定量兩種。在非標定量策略中，蛋白或肽段通過一級質譜或串級質譜信號強度、譜峰面積及譜圖數進行定量。同位素標記定量時給肽段引入一個穩定的同位素標記，使得肽段分子量發生改變，通過比較不同同位素標記的肽段的豐度從而對蛋白進行定量。常用的同位素標記方法包括化學反應法、代謝標記法以及酶促標記法?；瘜W標記法中常用的有ICAT (isotope-coded affinity tags)和ITRAQ(isobaric tag for relative and absolute quantitation)技術[61]。

陳寧等[62]從刺參水煮液提取到糖蛋白粗制品，得到了分子質量分別為964.3 kD和2.5 kD的兩種糖蛋白，通過液相色譜—質譜技術確定其含有氨基葡萄糖、甘露糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖6種單糖，含有18種氨基酸，包括8種人體必需氨基酸，半必需氨基酸組氨酸的含量占比最高，還鑒定出該糖蛋白含有酸性黏多糖物質。王曉斐[63]以中國對蝦為研究對象，經免疫印跡確定過敏原組分為Pen c 1，結構分析的結果表明Pen c 1是分子量為36 kD的糖蛋白，蛋白質二級結構為α-螺旋，含有D-甘露糖和D-葡萄糖，存在O-糖苷鍵，經質譜分析表明122位天冬酰胺為Pen c 1的N-糖基化位點，第101位蘇氨酸為潛在的O-糖基化位點。液相色譜-串聯質譜技術也被廣泛應用于糖蛋白的檢測，李鳳等[64]采用液相色譜-串聯質譜法分析新紅細胞生成刺激蛋白的肽質量指紋圖譜和糖肽結構，根據MS/MS碎片信息，結果顯示出3種類型的O-糖肽，其糖鏈組成為GalNAcGal(Neu Ac)_2、GalNAcGal(NeuAc)_1和GalNAcGal。江靜等[65]采用自制的親水固相萃取富集柱和生物質譜鑒定技術，對糖基化蛋白質核糖核酸酶B進行系列分析。結果表明：其糖基化位點為34位的Asn，糖鏈主要為5種高甘露糖型結構(Man5-9GlcNAc2)。侯向昶等[66]采用超高效液相色譜-串聯質譜技術對燕窩中唾液酸含量進行測定，結果顯示五種不同的燕窩唾液酸含量在6.0%～8.5%之間。同時劉彥品[67]也利用該技術測定奶粉中唾液酸含量，該方法前處理簡單、快速、重復性好、靈敏度高，可廣泛用于母乳、牛乳和奶粉中唾液酸含量的測定。

4 結 語

水產品糖蛋白具有復雜的結構和化學性質，根據結構與性質的不同可以采用不同的提取富集方法，但目前各種先進的糖蛋白富集分析的方法多是針對于人體血液等組織的檢測，應用于水產品糖蛋白的分析相對較少。隨著水產品糖蛋白結構性質的研究深入，將會有更多更好的技術應用于水產品糖蛋白的分離分析。每種提取和富集的方法各有利弊，綜合來看，在研究過程中最好可以結合不同方法的優勢，采用多種方法相結合來進行更有效更全面的提取、富集分離、分析水產品糖蛋白。我國有豐富的海洋資源，為我們對水產品糖蛋白的研究提供了便利，但目前對其結構的研究較少，今后應基于蛋白質組學和糖組學的先進技術手段加強對糖蛋白的結構和功能的深入研究。