三唑磷對斑馬魚肝臟氧化損傷作用研究

李方敏，姚燦燦，丁存寶

（華北理工大學生命科學學院，河北唐山063000）

三唑磷是一種廣譜性有機磷殺蟲劑，主要被用來防治蠅類幼蟲、地下害蟲等，進入水體后會毒害水生生物，并對水體環境造成長期的不良影響[1]。三唑磷在進入生物體后，會刺激生物體內活性氧自由基的產生，使得活性氧自由基的數量迅速增加，進而產生氧化應激反應。生物體內抗氧化體系的變化，對檢測、防治水污染具有重要意義[2]。不同的三唑磷濃度會對斑馬魚體內的超氧化物歧化酶[3]、過氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶等與活性氧自由基[4]清除相關的酶系統造成一定的影響。因此，本研究對這種影響進行定量分析，為斑馬魚作為污染檢測指示生物提供理論依據[5]。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

三唑磷試劑購買自北京鼎瑞（集團）化工有限公司，配制成濃度為0.05 μL/L、0.50 μL/L、1.20 μL/L的溶液。

將購買的斑馬魚等量分為4組，每組50條，分別喂養在3種三唑磷濃度的小魚缸中，持續喂養4周。每周從各魚缸中取出10條斑馬魚進行后續實驗。

1.2 勻漿制備

將斑馬魚放置在冰上，以達到迅速致死的效果；使用解剖鏡對斑馬魚進行解剖，將肝臟取出，并準確稱取肝臟的質量；加入生理鹽水，在冰水浴條件下機械攪勻；在 2 500 r/min 條件下離心 10 min，取上清液，用生理鹽水進行10倍稀釋，并進行后續測定。

1.3 生理生化指標測定

1.3.1 總蛋白含量采用測定（BCA法）

堿性條件下，待測樣品中的蛋白質將Cu2+還原為Cu+，Cu+和BCA試劑反應，產生一種紫色絡合物，可于562 nm處測定吸光度值，并計算出蛋白質的濃度。

1.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）的測定（羥胺法）

黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生的·O2可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，與顯色劑作用呈紫紅色，用可見光分光光度計測其吸光度。被測樣品中含SOD，會抑制·O2的產生，亞硝酸鹽的濃度因此降低。

1.3.3 過氧化氫酶（CAT）的測定

過氧化氫酶會分解過氧化氫，三唑磷的刺激會降低過氧化氫酶的活性，使得過氧化氫的含量增加，通過檢測過氧化氫的含量來測定過氧化氫酶。

1.3.4 脂質過氧化（MDA）的測定（TBA法）

脂質過氧化形成的丙二醛與硫代巴比妥酸進行縮合反應，生成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰，可通過測定紅色產物含量計算脂質過氧化。

1.3.5 乙酰膽堿酯酶（AChE）的測定

AChE使乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，剩余乙酰膽堿與羥胺作用生成乙酰羥胺，再與鐵離子在酸性溶液中形成棕色復合物，可通過測定棕色復合物含量計算乙酰膽堿酯酶。

2 結果與分析

2.1 斑馬魚活力及形態變化

斑馬魚體長 2～3 cm，體重約 0.3 g。前兩周，斑馬魚活力正常，進食狀況良好。隨著時間的推移，三唑磷濃度為1.2 μL/L的浴缸中，斑馬魚開始出現進食量減少、游動活力減弱的現象。實驗期間，3組斑馬魚均未出現死亡情況。

2.2 三唑磷對總蛋白含量的影響

分析圖1可知，三唑磷處理1周時，低濃度的三唑磷能夠適當促進總蛋白含量的提升，但隨三唑磷濃度的繼續升高，總蛋白含量會低于對照組；處理2、3、4周后，3個三唑磷處理組相較于空白對照組，總蛋白含量均呈現下降趨勢，但0.5 μL/L濃度的三唑磷對總蛋白含量影響最小。

圖1 三唑磷對斑馬魚總蛋白含量的影響

2.3 三唑磷對超氧化物歧化酶（SOD）的影響

分析圖2可知，隨著三唑磷農藥濃度的升高，SOD比活力呈現出先升高后下降的趨勢。三唑磷濃度為0.5 μL/L時，SOD的比活力最高；三唑磷濃度為1.2 μL/L時，SOD比活力降低。

圖2 三唑磷對斑馬魚SOD比活力的影響

2.4 三唑磷對過氧化氫酶（CAT）的影響

分析圖3可知，在前3周，隨著三唑磷農藥濃度的升高，CAT的比活力表現為先升高后降低。三唑磷農藥濃度為0.05 μL/L時，比活力升高幅度最為明顯，但是，隨著處理時間的加長，升高幅度會逐漸下降。在處理一周之后，對照組的CAT比活力值異常偏低。在第四周的時候，CAT的比活力先下降，后又升高，與前三周的情況正好相反。

2.5 三唑磷對脂質過氧化（MDA）的影響

由圖4可知，經過三唑磷處理之后，同對照組相比，丙二醛的含量迅速降低，且呈劑量依賴性。

圖3 三唑磷對斑馬魚CAT比活力的影響

圖4 三唑磷對斑馬魚MDA含量的影響

2.6 三唑磷對乙酰膽堿酯酶（AChE）的影響

分析圖5可知，在處理一周之后，三唑磷濃度為0.05 μL/L和1.2 μL/L的AChE比活力明顯下降，而三唑磷濃度為0.5 μL/L的AChE的比活力則升高。處理兩周之后，AChE的比活力均下降，并且隨著處理時間的加長，下降的幅度越來越大。

圖5 三唑磷對斑馬魚AChE比活力的影響

3 討論

超氧化物歧化酶的功能是清除活性氧自由基，能夠將超氧自由基轉換為氧氣和過氧化物。將斑馬魚飼養在含有三唑磷農藥的水中，斑馬魚的正常生長發育會受到影響，其體內的活性氧自由基數量會迅速、大量地增加[6]，與清除活性氧自由基相關的酶系統的活性將會被激發。隨著刺激時間的加長，活性被激發得越徹底。但是，三唑磷濃度過高時，斑馬魚體內的酶系統會遭到破壞，超氧化物歧化酶可能會失活，比活力將會下降。

動物肝臟中CAT的含量很高，其主要功能是催化生物體內的過氧化氫發生反應，使其轉化成分子氧和水[7]。隨著三唑磷刺激時間的加長、農藥濃度的升高，CAT的活性會被抑制，甚至失活。試驗中，三唑磷濃度為1.2 μL/L時，CAT的比活力呈現上升趨勢。

脂質過氧化的最終產物是丙二醛。生成丙二醛之后，細胞膜的通透性會被破壞，流動性會降低。生物體內的蛋白質等生物大分子還能與丙二醛發生反應，從而使其自身的結構和功能被改變，細胞正常的代謝功能會受到阻礙[8]。

乙酰膽堿酯酶[9]（AChE）在生物體內主要發揮解毒的功能，對三唑磷的存在有一定的指示作用。當乙酰膽堿酯酶的抑制率達到20%時，就能證明毒害作用的存在。當斑馬魚受到三唑磷的毒害作用時，乙酰膽堿酯酶的活性也會受到影響，會刺激具有解毒作用的AChE活性增強。隨著處理時間的加長，以及三唑磷濃度的增高，對蛋白酶的活性抑制作用也越來越強，AChE的量會減少，活性也會受到抑制。

4 結論

由實驗數據可知，隨著三唑磷濃度的升高，斑馬魚體內的SOD、CAT比活力會呈現出先升高后下降的趨勢；MDA的含量會呈現出明顯的下降趨勢。根據這一結果，可以將斑馬魚作為污染檢測的指示生物。用待檢測的水處理斑馬魚，檢測斑馬魚體內SOD、CAT、MDA的變化，如果符合上述變化趨勢，則說明水質可能被某種農藥污染。