基于rDNA-ITS序列對黑枸杞內生真菌分類鑒定

楊小朵，藍秋菊，韋冠宇，鄭敬暉，劉俊林

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730000）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）屬于茄科（Solanceae）枸杞屬（LyciumL.），主要分布于我國青海、新疆、寧夏、內蒙古和西藏等地區。據記載，黑果枸杞果實具有強腎潤肝、明目健胃的作用，也可用于治療心熱病、心臟病、月經不調等，在民間多作為滋補強壯藥物和降壓藥使用[1]。另外，黑枸杞的葉片和根被廣泛地加工為飲用泡茶。黑果枸杞果實中含有豐富的維生素，如維生素B1、維生素B2、維生素C，還富含Fe、Zn、Se等無機元素，同時含有天然色素類胡蘿卜素，其提取物也有較強的抗氧化作用[2]。

植物內生真菌作為植物整體的一個重要組成部分，在植物的生長、發育、次生代謝產物的積累以及對環境適應等方面扮演著非常重要的角色[3]。內生真菌（Endophyte）是指與健康植物共生，且不會引起宿主植物明顯病癥的一類真菌。由于植物內生菌與植物之間長期的共生關系，使得這類微生物具有對植物的促生長和賦予植物抗逆性的作用，一些植物中的內生菌還可以產生同植物宿主相同或者相似的活性物質[4]。

核糖體轉錄間隔區（rDNA-ITS）包括ITS1-5.8S-ITS2，不被轉錄翻譯成蛋白質，其進化速率相對較快，適合種及種以下的分類鑒定[5]。目前，有關黑枸杞的研究主要集中在活性成分提取、植物組織培養、生理機制等方面，而關于黑枸杞中內生菌分類的研究則少有報道。

本研究以藥用植物黑枸杞中已分離出來的10株內生真菌為研究材料，利用PCR方法，擴增rDNAITS序列，并應用直接克隆測序及形態學鑒定相結合的方法對這10株真菌進行分類鑒定，確定其種屬地位，為黑枸杞內生真菌進行系統分類，為闡明黑枸杞中的真菌類群提供基礎數據，為分離青海地區藥用植物黑枸杞中的活性天然產物提供寶貴的真菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑枸杞購自青海省海西地區，經西北民族大學劉俊林副教授鑒定為黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.），鑒定完成后立刻進行內生真菌的分離及培養；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、亞甲基藍（北京索萊寶科技有限公司）；Taq酶（日本東洋紡公司）。

HWS型智能恒溫恒濕箱（寧波東南儀器有限公司）；BME生物顯微鏡（上海徠卡顯微系統有限公司）；真菌全基因組提取試劑盒、引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）與ITS4（TCCGCTTATTGATATGC）（京索萊寶（Solarbio）科技有限公司）。

1.2 內生真菌的分離純化

黑枸杞中內生真菌的分離采用常規的組織塊分離法。分別選取健康植物材料的根、葉、莖和果實，于自來水下流水沖洗干凈，置無菌去離子水中漂洗，用已滅菌吸水紙吸干水分，截取1.0 cm左右的小段進行表面消毒：（1）無菌條件下，于75%乙醇中滅菌30 s，無菌水沖洗2次；（2）3%次氯酸鈉溶液消毒3～5 min，無菌水漂洗3次。消毒完成后用無菌濾紙吸干水分，將消毒好的植物材料橫切成厚約1.0 mm的薄片，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上，每皿9塊材料，15 ℃低溫暗培養，定期觀察。待組織塊邊緣有真菌菌絲生長，即可轉皿純化，已純化的菌種在-80 ℃（10%甘油）條件下保藏[6]。

1.3 10株黑枸杞內生真菌的形態學鑒定

將10株內生真菌接種于PDA培養基上培養。期間記錄其生長速率并詳細描述其宏觀特征如菌落形狀、大小、顏色、氣味、質地等。從PDA板上挑取生長3～5 d的菌落邊緣菌絲，采用透明膠帶法制片，置于顯微鏡下觀察菌絲、孢子、孢子梗的形狀大小等顯微特征[7]。

1.4 10株內生真菌基因組提取及序列擴增

使用真菌基因組提取試劑盒提取10株內生真菌DNA，使用通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')/ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')對rDNA的ITS片段進行擴增，PCR反應條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性 30 s，50.3 ℃退火 30 s，68 ℃延伸 90 s并進行35個循環，最后72 ℃延伸7 min；PCR擴增采用20 μL反應體系，包括預混Taq酶10 μL、雙蒸水6.6μL、DNA 1.8 μL、Primer-F/R 各 0.8 μL[8]。PCR 產物純化后送交上海生物工程科技有限公司測序。

1.5 10株內生真菌的系統發育學分析

對雙向測序得到的基因序列拼接并檢查，將測序結果提交到GenBank。使用10株內生真菌的ITS序列作為查詢序列，在NCBI中進行BLAST比對，下載與查詢序列相似的序列。得到13條ITS序列，所得序列用于后續的系統發育分析。采用MAFFT網頁服務器（https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）對同源序列進行多序列比對，使用MEGA7軟件手動調整序列[9]。核苷酸替換模型使用MrModeltest 2.3進行選擇[10]，采用raxmlGUI 1.5軟件[11]按照最大似然法（ML，Maximum likelihood），自展數（bootstrap）為 1 000，構建系統發育樹。

2 結果和分析

2.1 10株內生真菌的形態學鑒定

10株內生真菌株在PDA培養基上28 ℃培養3 d后，有7株真菌的菌落直徑為1.6～2.0 cm，菌落質地絨毛狀，菌絲白色，圖1（A和D），4～6 d菌絲變黃，菌落端生黃色分泌液滴，基底為棕黃色，菌絲光滑有隔；孢子光滑，呈橢圓狀。1株菌株在PAD培養基上培養 7 d后，直徑 2.8～3.1 cm，如圖1（B 和 C），在PAD培養基上培養2～3 d時，菌落初均為白色，后產色素變紅，基地為黃紅色、絨氈狀，菌絲分枝、分隔；分生孢子倒梨形，單生或至多10個成短鏈狀，孢子囊球形；孢子梗菌絲狀，子囊孢子橢圓形，表面平滑。1株菌株的菌落為綠色，菌落質地氈狀，基地顏色為黃綠色，產生分生孢子，表面光滑，見圖1。1株菌株菌落為青綠色，表面粗糙，有火山口的瘤狀突起，基地為綠色，分枝成帚狀的分生孢子，各頂端的小梗產生鏈狀的的分生孢子，見圖1（E）。通過與《真菌鑒定手冊》等資料[12-15]比對，可以基本確定10株內生真菌的種屬，10株內生真菌中的7株菌株鑒定為鬼傘屬（Coprinellus radians）；1株菌落鑒定為木霉屬（Trichoderma）；1株菌落鑒定為血紅紅曲霉（Monascus sanguineus）；1株鑒定為青霉菌屬（Penicillium）。然而，僅依據形態學特征很難準確地鑒定物種的種屬。因此，可以采用序列分析的手段來獲得更多的遺傳信息并進行進一步的分類。

圖1 黑枸杞中內生真菌的菌落及孢子形態

2.2 10株黑枸杞內生真菌的ITS序列分析

測序后得到1株內生真菌的ITS序列長度為1 540 bp，整理后提交 GenBank，獲得 ITS 序列號為MF372833。

如圖2所示，根據ITS序列構建的系統發育樹可以看出G-GEN-7（圖1B和1C）與Monascus sanguineus菌株處于同一分支，親緣關系較近，同源性達98%；經過PCR擴增后獲得的7株內生真菌的ITS序列長為454～465 bp，該序列的序列號為KT192203，同源性為98%，綜合ITS序列分析和形態學特征結果，將7株菌株鑒定為鬼傘屬（Coprinellus radians）；1株內生真菌的ITS序列長度為589 bp，該序列的序列號DQ339557，同源性79%，綜合形態學特征和ITS序列分析結果，將此株菌株鑒定灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）；1株內生真菌的ITS序列長度為611 bp，該序列的序列號AF456922，同源性98%，綜合形態學特征和ITS序列分析結果，將此株菌株鑒定為綠色木霉（Trichoderma viride）。ITS區進化速度較快，在真菌的種間存在著明顯豐富的變異，但在種內不同菌株間卻高度保守，可以用其鑒定到種及以下水平。

圖2 基于rDNA-ITS基因序列的10株內生真菌的進化樹

3 結論

本研究對從青海海西購買的黑枸杞中純化分離的10株內生真菌進行了綜合形態學觀察和序列分析，將其中的7株菌株鑒定為鬼傘屬（Cop rinellus radians），1株菌落鑒定為綠色木霉（Trichodermaviride），1株菌落鑒定為血紅紅曲霉（Monascus sanguineus），1株鑒定為灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）。獲得的10株內生真菌菌株的鑒定拓寬了植物內生真菌的來源，同時為研究黑枸杞及10株內生真菌菌株的初級代謝和次級代謝產物奠定了基礎。