李慧靈，陳宏基，林育成，葉德曉，周金林

（廣東金駿康生物技術有限公司，廣東佛山 528000）

淫羊藿素（Icaritin，ICT）為淫羊藿苷（Icariin，ICA）的衍生物。研究表明，淫羊藿具有增強人體免疫功能、延緩衰老、防治神經性疾病等作用。而淫羊藿苷作為淫羊藿的主要活性單體成分，口服生物利用度只有12%，其效應是通過代謝成淫羊藿素后起作用[1]。近年來，淫羊藿素在抗腫瘤、抗肝纖維化、抗骨質疏松、神經保護、改善前列腺功能、免疫抑制、抗炎、抗氧化等方面的作用被逐漸發掘[2-3]。為提高淫羊藿的生物利用度，將淫羊藿苷轉化為人體更容易吸收的淫羊藿素成為很多學者的研究方向。目前，對淫羊藿苷轉化淫羊藿素常用的方法是酶酸結合法，即先用酸解將淫羊藿苷元3位上的鼠李糖水解掉，再用纖維素酶或β-葡聚糖將7位上的葡萄糖水解掉。此方法用到了酸，對環境造成一定危害，且收率較低，只有62.5%[4-5]。另外，也有采用酶水解的，如柚苷酶[6]、纖維素酶和葡萄糖苷酶水解等，其中柚苷酶的水解產物是淫羊藿素，但反應時間長達11 d；其他酶的水解產物是淫羊藿次苷Ⅱ，酸水解的產物是淫羊藿次苷Ⅰ和β去水淫羊藿素。本研究從土壤中篩選出一株產β-葡萄糖苷酶，可以將淫羊藿苷轉化為淫羊藿素。基于此，通過單因素實驗和正交實驗優化此種酶的酶解工藝，以提高淫羊藿素的轉化率。

1 材料與方法

1.1 藥劑與儀器

98%淫羊藿苷（西安天本生物工程有限公司），β-葡萄糖苷酶（本公司自產），淫羊藿苷標準品（≥98%）、淫羊藿素標準品（≥98%）均購自sigma公司，一水檸檬酸（≥99.5%）、十二水合磷酸氫二鈉（≥99%）購自廣東光華科技股份有限公司。

HT-110X30水浴搖床，上海赫田科學儀器有限公司，安捷倫1100液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 液相檢測條件

色譜柱：C18柱ODS，250×4.6 mm；流動相：乙腈（流動相A），0.5%醋酸水溶液（為流動相）B；流速 1 mL/min，波長 281 nm，柱溫 30 ℃，進樣量10μL；洗脫程序中流動相A與B的比例按照30 ∶ 70（0～10 min）、50 ∶ 50（10～20 min）、85 ∶ 15（20～25 min）、30 ∶ 70（25～30 min）的洗脫條件設置。

1.3 數據分析

數據采用SPSS 16.0進行分析，并用origin 8.1繪制圖表。

2 單因素實驗

2.1 溫度對酶解反應的影響

分別在 35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃條件下進行酶解反應，實驗中原料采用淫羊藿苷的30倍緩沖液，pH為5，底物與酶的比例為6∶1，反應時間為 20 h。

從圖1中可以看出溫度低于40 ℃條件下，轉化率隨溫度的升高而升高，超過50 ℃后隨溫度的升高而降低，在50 ℃時酶解轉化率達到最大，即95%。因此，酶的最適溫度范圍為40～50 ℃，最佳溫度為50℃。低溫時，分子運動較慢，β-葡萄糖苷酶酶活較低，淫羊藿次苷Ⅰ的轉化率較低；而溫度過高時，酶的空間結構會遭到破壞，從而使酶活降低，轉化率降低。因此選擇40 ℃、45 ℃和50 ℃ 3個溫度水平進行正交試驗。

圖1 溫度對酶解反應轉化率的影響

2.2 pH對酶解反應的影響

分別在pH為3、4、5、6、7條件下進行酶解反應，實驗中原料采用淫羊藿苷的30倍緩沖液，溫度為50℃，底物與酶的比例為6∶1，反應時間為20 h。

從圖2中可以看出最適的pH范圍在4～6，酶解反應的最佳pH是5，原因可能是pH為5的條件下，β-葡萄糖苷酶的活力最高，淫羊藿素的轉化率最高，而pH過低或過高都會影響酶的活性。如圖中pH為3時，轉化率只有10%，過酸的緩沖液影響了酶的結構，使酶失活；同理pH過高也會影響酶的活性。從結果看可以選定pH為4、5、6這3個水平進行正交試驗。

圖2 pH對轉化率的影響

2.3 緩沖液的倍數對酶解反應的影響

分別在20倍、30倍、40倍、50倍、60倍的緩沖液體系下進行酶解反應，實驗溫度為50 ℃，pH為5，底物與酶的比例為6∶1，反應時間為20 h。

從圖3可以看出在20～60倍的緩沖液倍數范圍內，淫羊藿苷濃度對酶解反應的影響不大，反應率都在90%以上，從酶解后體系的狀態看，由于反應是水解糖的過程，體系中鼠李糖和葡萄糖的濃度逐漸增加，緩沖液倍數過小，糖濃度過高會導致體系較黏，不利于后處理；而緩沖液倍數過大，在工業化生產中也會導致后處理量大、生產量降低等問題，因此選擇緩沖液的倍數為30倍進行正交試驗。

圖3 緩沖液的倍數對轉化率的影響

2.4 底物與酶的比例對酶解反應的影響

分別在底物與酶為10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1的比例下進行酶解反應，實驗中原料采用淫羊藿苷的30倍緩沖液，溫度為50 ℃，pH為5，反應時間為 20 h。

從圖4可以看出，隨著酶量的增大，酶解反應的轉化率也隨之增大，但都在93%以上。繼續增加酶量可能會使轉化率得到進一步提高，但這會大大增加成本。因此，選擇10∶1、8∶1和6∶1這3個水平進行正交實驗。

圖4 底物與酶的比例對轉化率的影響

2.5 反應時間對酶解反應的影響

以淫羊藿苷的30倍緩沖液為原料，在溫度為50℃，pH為5，底物與酶的比例為1∶0.4的條件下進行酶解反應，分別檢測 5 h、10 h、15 h、20 h 和 25 h后淫羊藿素的轉化率。

從圖5可以看出，反應在前5 h，淫羊藿素轉化率達到70%以上，而在20 h后，反應速率逐漸降低，這可能與產物抑制有關。在淫羊藿苷水解的過程中，緩沖液中鼠李糖和葡萄糖濃度的不斷增加，會抑制淫羊藿素的生成，降低反應速率，即20 h后，酶解反應基本達到平衡。

3 正交實驗優化酶解工藝

3.1 正交實驗設計

在單因素試驗的基礎上，以淫羊藿素的轉化率為指標，采用L9(34)正交表設計四因素、三水平的正交實驗。每個實驗做兩個平行，因素水平表如表1所示。

圖5 酶解時間對轉化率的影響

表1 淫羊藿素酶解工藝正交實驗因素水平表

3.2 正交實驗結果

根據表1因素水平表，按照L9(34)正交表設計正交實驗，實驗結果如表2所示。從表2可以看出各因素對淫羊藿素轉化率的影響大小順序為B（pH）=C（酶解時間）＞A（溫度）＞D（底物與酶比），且最佳的酶解工藝條件為A3B2C2D3，即溫度50 ℃，pH為5，酶解時間為20 h，底物與酶比為6∶1。

表2 正交實驗條件下淫羊藿素轉化率

3.3 最佳工藝驗證

根據正交實驗優化后的工藝條件進行3次平行實驗，實驗結果如表5所示。工藝優化后的平均轉化率可達95.73%，高于正交實驗組的任何一組實驗。

表3 最佳工藝表

4 結論

本次實驗以淫羊藿苷為原料，利用β-葡萄糖苷酶進行酶解實驗，轉化淫羊藿，通過正交實驗得出了4個因素對轉化率的影響順序為pH=酶解時間＞溫度＞底物與酶比，在50 ℃、pH為5、酶解20 h、底物與酶比為6∶1的最佳工藝條件下，平均轉化率為95.73%。