曾艷，吳爍

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

呋喃妥因（NFT）又名硝呋妥因和呋喃坦丁等，為黃色結晶性粉末，無臭，遇光色漸變深，曾作為預防和治療胃腸道感染的抗菌藥在禽類、水產和家畜中廣泛使用[1]。NFT內服后會在體內迅速代謝，代謝產物為1-氨基-乙內酰脲（AHD）。AHD可以與組織蛋白質結合，形成穩定的結合物，在動物體內殘留數周之久，被人攝入后，可經人胃消化轉移至人體內[2]，1-（2-硝基苯亞甲基）-氨基乙內酰脲（NPAHD）為其衍生物。范菲等[3]通過研究呋喃妥因及有關物質對大鼠的長期毒性，推斷大劑量呋喃妥因有溶血作用，會對腎、肝、心產生不利影響。歐盟已將所有的硝基呋喃類抗生素全部列為違禁藥物，我國也明確將其列為飼養過程中禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出[4]。衛生部于2010年將呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林列入可能違法添加的非食用物質黑名單，加強監管。

早期呋喃妥因的檢測大多是針對原藥，結果均不理想，現在多檢測動物組織中的AHD含量，間接反映原藥使用的殘留情況。目前應用最廣泛的儀器分析方法主要有高效液相色譜（HPLC）、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）、超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）等。國家發布的GB/T20752-2006、GB/T21311-2007以及農業部公告第235號等均采用LC-MS/MS法。該法適用范圍覆蓋水產品、肌肉組織、動物內臟、蜂蜜和腸衣農產品等。

免疫分析作為一種既特異又敏感的檢測方法，在食品中藥物殘留檢測中被廣泛應用。彭鵬[5]使用膠體金技術研制的呋喃妥因代謝物AHD膠體金試紙條檢測限為5 μg/kg（以NPAHD計），檢測時間約10 min；動物源性食品檢測限為0.8 μg/kg，以AHD計。

炭黑是一種由類球形小粒子構成的具有局部石墨化結構的無定形炭。炭黑表面存在一定的有機官能團，包括羧基、酚羥基、羰基等。1993年，炭黑首次作為標記物用于免疫分析[6]。何卓等[7]制作膠體碳試紙條用于檢測瘧原蟲，以檢測帶的灰度值定量。與膠體金的紅色相比，膠體碳試紙條反應后的黑色與白色的硝酸纖維素膜形成更大的顏色反差，更易辨別[8]。基于此，利用膠體碳作為標記物標記抗體，建立硝基呋喃類藥物殘留的免疫層析試紙條方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1-氨基-乙內酰脲-BSA偶聯物、1-氨基-乙內酰脲單克隆抗體、羊抗鼠二抗體、NPAHD、牛血清白蛋白（BAS）（美國Sigma公司）；硝酸纖維素膜（HF90，HF135）、GFCP 203000玻璃纖維墊（美國Millipore公司）；SB06玻璃纖維素膜、吸水紙、PVC背板（上海金標生物科技有限公司）；SB4炭黑（德國德固賽公司）；多寶魚、鱸魚、鯽魚、草魚4種水產品，均于超市購買。LTI-700低溫恒溫培養箱（上海EYELA）；VT 6025真空干燥箱（天津三水儀器有限公司）；5804A冷凍離心機（德國EPPENDORF公司）；BL610分析天平（賽多利斯儀器系統有限公司）；HM3030雙維往復劃膜儀、ZQ2002微電腦自動斬切機（上海金標生物科技有限公司）。

1.2 溶液制備

BB（0.01mol/L pH7.6）：準確稱取 1.051 45 g 硼酸和 0.286 05 g硼砂，加水定容至 2L；PB（0.1mol/L pH7.4）：準確稱取2.964g磷酸二氫鈉和29.011g磷酸氫二鈉，加水定容至 1L；PB（0.01 mol/L pH7.6）：準確稱取0.202 8g磷酸二氫鈉和3.116 0g磷酸氫二鈉，加水定容至1L； PBS：準確稱取9g NaCl溶于1L相應濃度 PB 溶液； PBST（0.1 mol/L pH 8.0）：準確稱取 10gBSA，1ml吐溫 -20 和 0.2g 疊氮鈉，0.826 8 g磷酸二氫鈉和33.917 8 g磷酸氫二鈉，加水定容至1L，上述溶液均在4℃保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 碳納米顆粒分散溶液的選擇

稱取適量炭黑固體，分別加入到一定pH值和濃度的磷酸鹽緩沖液（PBS）、硼酸鹽緩沖液（BB）和磷酸緩沖液（PB）中，冰浴超聲20 min，配制成膠體碳溶液，室溫下靜置一段時間，觀察碳顆粒在緩沖體系中的分散性和穩定性。

1.3.2 膠體碳標記抗體的制備

（1）將1-氨基-乙內酰脲單克隆抗體用選擇出的分散溶液稀釋至5 mg/mL。

（2）緩慢攪拌條件下將一定量抗體加入到適量膠體碳溶液中，4 ℃條件下緩慢攪拌過夜。

（3）混合液體全部轉移至離心管中并記錄體積，在 14 000 r/min、4 ℃、條件下離心 15 min，棄去上清夜，并用緩沖液重復洗滌2次。最終沉淀用洗滌緩沖液重懸至初始體積，4 ℃保存備用。

1.3.3 膠體碳標記免疫層析試紙條檢出限的確定

配制一系列濃度的NPAHD標準品溶液：0 μg/L、0.1 μg/L、0.2 μg/L、0.3 μg/L、0.5 μg/L、0.7 μg/L、1.0 μg/L和2.0 μg/L，與膠體碳標記抗體混合后，吸取100 μL跑條，選擇檢測線顏色與空白對照檢測線顏色有明顯差別時的最低標準品濃度作為試紙條檢出限。

1.3.4 膠體碳標記免疫層析試紙條特異性測試

選取硝基呋喃類及其衍生物與其他獸藥共計14種，用制備好的試紙條進行檢測，以確定其特異性。

1.3.5 試紙條對實際樣品的檢測效果

1.3.5.1 實際樣品前處理方法

將多寶魚、鱸魚、鯽魚、草魚4種不同動物組織的樣品切碎，用勻漿機在4 000 r/min條件下均質5 min后進行衍生處理和萃取處理[5]。

衍生處理：稱5.0 g的樣品于50 mL離心管中，加入 10 mL 去離子水和 2 mL 的 1 mol/L HCl溶液，混勻后加入300 μL的鄰硝基苯甲醛溶液（50 mmol/L），混勻，置于 60oC 水浴中，反應 180 min。

萃取處理：將衍生后的樣品取出恢復至室溫，加 入 5 mL 的 PBS（0.2 mol/L） 和 1.6 mL 的 NaOH（1 mol/L）溶液，調節pH至中性；再加入 7 mL乙酸乙酯，漩渦混勻 30 s后在 5 000 r/min 條件下離心 10 min，取上層即乙酸乙酯層于10 mL離心管中，50oC氮氣吹干；加2 mL正己烷復溶后加入1 mL的PBS緩沖溶液，震蕩混勻后于 5 000 r/min 條件下離心 10 min，上層正己烷層棄掉，下層溶液檢測用。

1.3.5.2 實際樣品添加回收試驗

經檢驗，多寶魚、鱸魚、鯽魚、草魚4種樣本的組織中均不含NFT及其代謝物AHD。向樣品中分別添加AHD標準品，濃度為0 μg/kg，0.2 μg/kg，0.5 μg/kg的。采用1.2.5.1的處理方法處理，使用試紙條檢測以確定實際樣本的檢測限。

2 結果與討論

2.1 碳納米顆粒分散溶液的選擇

（1）由于炭黑顆粒表面含較多的羧基，優先選擇pH為7.6的緩沖液進行分散。稱3 mg炭黑，分別加入到 10 mL濃度為0.01 mol/L、pH為7.6的 BB、PBS、PB緩沖液中，冰浴超聲20 min，形成濃度為0.3 mg/mL的膠體碳溶液。室溫下靜置24 h，3種溶液均未出現明顯分層、沉淀。

（2）將上述膠體碳溶液參照1.2.2方法標記1-氨基-乙內酰脲單克隆抗體，并組裝試紙條，檢測結果見圖1。PBS和PB溶解的碳納米顆粒標記抗體，試紙條檢測線和質控線顏色很淡，肉眼辨識困難。BB緩沖液溶解的試紙條能較好顯色，并對不同濃度的標液呈現顏色梯度。因此，選擇BB緩沖液作為碳納米顆粒的分散溶液。

圖1 碳納米顆粒分散溶液的選擇

2.2 膠體碳標記免疫層析試紙條檢出限的確定

使用0.1 mol/L、pH為7.4的PBS緩沖液稀釋包被抗原8倍、羊抗鼠二抗70倍，選擇Millipore135s膜，噴涂量為0.8 μL/cm，干燥后組裝試紙條。配制一系列濃度的NPAHD標準品溶液，吸取4 μL膠體碳標記抗體與標準品混勻，用標準品稀釋液（0.1 mol/L、pH為8.0的PBST）定容至100 μL上樣，結果如圖2所示。添加標準品濃度達到0.5 μg/L時，檢測線和質控線有明顯差異，當加標量到達1.0 μg/L時，檢測線徹底消失。多次重復試驗表明：該試紙條目測時檢出限為 1.0 μg/L。

圖2 試紙條檢出限的確定

2.3 膠體碳標記免疫層析試紙條特異性測試

添 加 NPAHD、NPPAOZ、NPAMOZ、NPSEM、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、AHD、AOZ、AMOZ、SEM、鄰硝基苯甲醛、對硝基苯甲酸檢測，試紙條結果見圖3。添加呋喃妥因和AHD時，試紙條檢測線消線顯著，可以認作有較低的交叉，可能是由免疫原的主體結構與原藥及AHD的相似所致，其他藥物的濃度高達1 000μg/L，檢測線仍正常顯色，即沒有交叉反應。

圖3 試紙條與其他獸藥的交叉反應

2.4 膠體碳標記免疫層析試紙條實際樣品的檢測

分別向4種陰性樣品中添加濃度為0 μg/kg、0.2 μg/kg、0.5 μg/kg的AHD標準品。加標樣品按1.2.5.1方法處理，試紙條檢測結果見圖4。4個空白本底樣的檢測線和質控線均能正常顯色，且一致性好；加標樣的檢測線顏色均明顯低于質控線，實驗中將檢測線徹底消失時的添加量作為樣品的檢出限濃度，則這4種樣品的檢出限均至少能達到0.2 μg/kg。

圖4 4種實際樣品中AHD的檢測

3 結論

（1）采用PB、BB和PBS溶液開展了碳納米顆粒分散試驗，結果表明BB緩沖液為最佳膠體碳分散液，最佳pH值為7.6，離子濃度為5 mmol/L。

（2）實驗建立了膠體碳標記免疫層析分析方法，試紙條選擇Millipore135s膜作為膜載體，包被抗原稀釋比例為1∶8，羊抗鼠二抗稀釋比例為1∶70，均選擇pH為7.4的0.1 mol/L PBS進行稀釋，跑條緩沖液選擇pH為8.0的0.1 mol/L PBST，反應時間控制在 10～15 min。

（3）選擇無殘留的水產品做本底，添加AHD，經衍生化、萃取，產物經由試紙條檢測，檢出限為0.2 μg/kg。

（4）試紙條使用步驟簡單，無需借助儀器，目測即可得出結果，可適用于大量樣品的快速篩選。