Mdivi-1對順鉑誘導的L1210細胞活性氧產生及凋亡的影響

危永芳，董佳瑤，吳沁璇，周碧蘭，吳昭全

（長沙醫學院藥學院，湖南長沙 410219）

急性淋巴細胞白血病是造血系統常見的惡性腫瘤，死亡率高，化療是其主要的治療手段之一。順鉑作為第一個被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于腫瘤治療的鉑類藥物，通過干擾細胞內DNA的轉錄和復制，誘導腫瘤細胞凋亡[1]，廣泛用于各種腫瘤的治療。線粒體作為細胞“動力工廠”，其功能的維持對保證細胞正常運轉具有重要意義。線粒體是高度動態變化的，能不斷地進行分裂和融合，該平衡的維持是保證線粒體正常生理功能的重要基礎[2]。線粒體動力相關蛋白（Drp1）作為一種重要的線粒體分裂蛋白，其過表達可促使線粒體分裂增多，導致線粒體呈顆粒狀。線粒體是活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的主要來源，Johanna等[3]的研究表明，較高水平的ROS與腫瘤細胞凋亡密切相關。而正常的線粒體形態對于維持細胞內ROS水平具有重要作用。本文通過研究Mdivi-1（一種Drp1抑制劑）對順鉑誘導的L1210細胞ROS產生及細胞凋亡的影響，探討Drp1介導的線粒體分裂與順鉑抗白血病作用的相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清（北京TransGen Biotech公司）；RPMI-1640培養基（美國Gibco公司）；青霉素/鏈霉素抗生素（美國Gibco公司）；Mdivi-1（美國Sigma公司）；順鉑（西亞試劑）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京四正柏公司）；活性氧檢測試劑盒（美國Sigma公司）。

Guava easyCyte HT 流式細胞儀（美國 Millipore公司）；二氧化碳培養箱（美國Thermo公司）；SW-CJ-2FD超凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；Legend micro 17小型臺式離心機（美國Thermo公司）；單道移液槍（德國Brand公司）

1.2 細胞培養

L1210細胞株購自武漢中國典型培養物保藏中心（CCTCC），用含1%雙抗、10% FBS的RPMI-1640完全培養基，于37℃、5% CO2的培養箱中進行常規培養。

1.3 ROS檢測

取對數生長期的L1210細胞，接種于6孔板中，分為對照組、DDP處理組、Mdivi-1+DDP處理組。DDP處理組加入400mg/mL的順鉑，Mdivi-1+DDP處理組加入5μmol/L的Mdivi-1預處理lh，再加入400mg/mL的順鉑，處理48 h；收集細胞，棄上清，用1 μmol/L的DCFH-DA探針1 mL重懸細胞。37℃避光孵育20min，PBS洗兩遍，將樣品加入圓底96孔板中，上流式細胞儀進行檢測。

1.4 細胞凋亡檢測

取對數生長期的L1210細胞，接種于6孔板中，按1.3項分組處理細胞48 h后，收集細胞，調節細胞濃度，取 100 μL 細胞懸液，加入 5 μL Annexin V/FITC和10 μL20 μg/mL的PI溶液混勻，避光處理15 min 后，加 400 μLPBS，上流式細胞儀進行分析。

2 結果與分析

2.1 Mdivi-1對順鉑誘導的L1210細胞中ROS的調控

如圖1所示，與對照組相比，DDP處理組熒光信號明顯增強，提示ROS水平增高，而5μmol/L Mdivi-1預處理可明顯降低順鉑誘導的L1210細胞內ROS的產生，但不能完全阻止活性氧的增加。該結果表明，Drp1可通過介導線粒體分裂來調節細胞內ROS水平，該過程可能與順鉑的抗白血病作用有關。

圖1 不同處理組細胞內ROS水平

2.2 Mdivi-1對順鉑誘導的L1210細胞凋亡的影響

如圖2所示，與對照組相比，DDP處理組細胞凋亡數量明顯增多，而5μmol/L的Mdivi-1預處理組，細胞凋亡數量明顯減少，說明Mdivi-1對順鉑誘導的細胞凋亡有明顯抑制。而Mdivi-1為Drp1的抑制劑，該結果提示Drp1參與了順鉑誘導的L1210細胞凋亡。

圖2 Mdivi-1對順鉑誘導的L1210細胞凋亡的影響

3 結論與討論

順鉑通過與DNA發生交聯反應，干擾DNA的轉錄和復制，誘導腫瘤細胞凋亡，發揮其抗腫瘤作用。線粒體作為細胞能量供應的主要場所，近年來線粒體動力學一直是細胞生物學的研究熱點，其運行情況對細胞及機體都至關重要。線粒體分裂和融合雖然不是同時進行，但卻高度協調，平衡一旦被打破常常會導致線粒體結構改變和功能障礙，導致ROS產生增加，而高水平的活性氧可誘導細胞凋亡。

本研究顯示，順鉑可誘導L1210細胞ROS的產生及細胞凋亡，而Mdivi-1預處理會顯著抑制順鉑誘導的ROS產生和細胞凋亡。相關研究發現了Drp1抑制劑Mdivi-1對順鉑誘導的caspases-3活化和細胞凋亡有抑制作用[4]。綜合這些研究結果，可以發現Drp1介導的線粒體分裂與順鉑的抗白血病作用息息相關，但其具體分子機制還需進一步研究探索。此外，順鉑耐藥性的產生是限制其臨床應用的重要原因。有研究顯示線粒體動態變化與順鉑耐藥性的產生有關[5]，而關于這方面的研究還需要進行深入的探索。