何彩文，蔣詠梅，章文賢

（工業微生物教育部工程研究中心，福建師范大學生命科學學院，福建福州 350117）

茯苓是一種寄生在松樹根部的真菌，具有菌核、菌絲體和子實體3種形態特征。茯苓多糖是真菌茯苓中具有多種藥理作用的主要活性成分，含量高達93%以上，主要存在于茯苓的細胞壁中。茯苓多糖中有水溶性多糖和堿溶性多糖兩種類型，其中多數為堿溶性多糖。大量研究表明，茯苓多糖可治療腹瀉、嘔吐、水腫、驚悸等癥狀，具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化以及免疫調節等生理活性，以及降血糖、鎮靜催眠、和胃益脾、退黃疸、消結石、增強機體免疫力、延緩衰老和改善學習記憶等藥理作用[1-4]，在臨床醫學、食品藥膳以及美容保健等領域具有廣泛應用[5]。

茯苓生產有固體栽培和液體發酵兩種途徑，野生茯苓和傳統栽培的人工種植茯苓均屬于固體培養。隨著現代發酵技術的發展，目前越來越多的方法采用液體深層發酵生產茯苓，對茯苓菌絲的生長條件和產物合成條件進行優化[6-9]。培養基的組成和環境條件，以及種子液的菌齡和接種量都會影響發酵結果。本研究采用一種液體搖瓶培養結合靜置培養的方法生產茯苓多糖，找出對茯苓菌的生長和對茯苓多糖合成效果均最好的液體培養時間和靜置培養時間，初步為采用這一方法生產茯苓多糖提供工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）培養7 d的斜面茯苓菌絲由福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心保藏并提供。

1.2 培養基制備

（1）斜面培養基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，MgSO40.5 g，KH2PO41.0 g，瓊脂粉 16 g。

（2）種子培養基（1 L）：葡萄糖 35 g，蛋白胨 5 g，酵母粉 2.5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 為 6.0。

（3）發酵培養基（1 L）：葡萄糖 35 g，蛋白胨 5 g，酵母粉 5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 為 6.0.

1.3 實驗方法

1.3.1 茯苓胞內多糖（IPS）的提取及測定

稱取茯苓干細胞粉末100 mg，加入1 mol/L氫氧化鈉于60 ℃水解1 h后，用水稀釋一定倍數，用濃硫酸-苯酚法測定胞內多糖含量[9]。

1.3.2 發酵條件優化方法

種子液制備：用無菌水10 mL，水洗28 ℃條件下培養6 d的斜面一支，接入裝有40 mL種子培養基的250 mL 搖瓶中，搖床（28 ℃，160 r/min）發酵，培養72 h，即為種子液。

發酵培養：500 mL搖瓶裝發酵培養基200 mL，接種量按 10% 接種，搖床（28 ℃，160 r/min）發酵，培養相應天數。

搖瓶培養時間設定 2 d、3 d、4 d 和 5 d；靜置培養時間 4 d、6 d、8 d、10 d、12 d 和 14 d。

2 結果與討論

2.1 靜置前液體發酵時間對茯苓菌絲細胞生長的影響

考察不同靜置前培養時間對后續靜置過程產生的影響。圖1結果表明，靜置前培養時間越長，越不利于茯苓菌絲的獲得，在第4 d和第8 d測定菌絲干重，均是培養2 d時細胞量最大，但在第4～8 d的生長過程中，靜置前培養時間越長，細胞的生長速率越大，前培養 2 d 和 5 d 的生長速率分別是 0.85 g/(L·d)和 1.13 g/(L·d)。

圖1 靜置前液體發酵時間對細胞生長的影響

2.2 靜置前液體發酵時間對胞內多糖含量和產量的影響

靜置前液體發酵時間對茯苓菌絲胞內多糖的積累影響較大。從圖2可見，經過3 d前培養的菌絲，茯苓菌絲胞內多糖含量最高，在靜置培養4 d和8 d后，胞內多糖含量分別高達 6.3 g/100 g 和 9.3 g/100 g CDW（CDW為細胞干重）。結合細胞量，如圖3所示，計算胞內多糖的產量同樣是在前培養3 d時最高，在靜置8 d時，胞內多糖產量達到1.14 g/L。后續試驗中采用前培養3 d的條件。

圖2 靜置前液體發酵時間對胞內多糖含量的影響

圖3 靜置前液體發酵時間對胞內多糖產量的影響

2.3 靜置時間對細胞生長的影響

在液體培養3 d后開始靜置培養，考察靜置培養時間對茯苓菌絲生長的影響。圖4結果表明，隨著靜置培養天數的增加，茯苓菌絲細胞干重迅速增長，超過5 d時細胞干重的增長趨勢逐漸平緩，當靜置培養天數約為12 d時細胞干重達到最大值，為 13.5 g/L。

圖4 靜置發酵時間對細胞生長的影響

2.4 靜置時間對胞內多糖含量和產量的影響

圖5結果表明，隨著天數增加，茯苓菌絲胞內多糖含量逐漸增多且增加趨勢逐漸平緩，在靜置培養時間為 10 d時胞內多糖含量達到最大值，為 9.8 g/100 g CDW，之后胞內多糖含量下降。因此，靜置培養10 d是茯苓菌絲胞內多糖含量的最佳時間。從胞內多糖產量來看，如圖6所示，隨著培養時間延長，胞內多糖產量不斷上升，在第10 d時達到最大值，為1.28 g/L。

圖5 靜置發酵時間對胞內多糖含量的影響

圖6 靜置發酵時間對胞內多糖產量的影響

3 結論

本研究采用搖瓶培養結合靜置培養的方法研究茯苓菌絲的生長和胞內多糖的合成。發現搖瓶培養時間和靜置培養時間對茯苓菌絲的生長和胞內多糖產量有明顯影響，經3 d搖瓶培養和10 d靜置培養的茯苓菌絲胞內多糖產量高達1.28 g/L，可見這種兩階段培養的方式是一種生產茯苓多糖的有效新方法。