油/水界面法制備硫化銅微粒及其抗菌性能研究

齊嘉欣，溫金熙，汪沁，周興平

（東華大學化學化工與生物工程學院，上海201620）

微生物感染是現代醫學所面臨的極其嚴峻的問題之一[1]，在人體生物材料植入、醫用材料使用等環節都有因細菌感染而產生嚴重后果的案例[2-5]，因此研發具有良好抗菌性的生物醫用材料能夠在一定程度上解決因細菌感染所帶來的醫學問題[6]。

金、銀、鋅和銅等金屬粒子廣泛應用于醫療器械、農業、診斷等領域[7-8]，其抗菌廣譜、毒性小且抗菌性能持久[9]，在抗菌材料的制備中具有重要的應用價值。在常用的抗菌性金屬粒子中，銅的抗菌性相較金、銀略差且極易被氧化[10]，但是銅價格便宜且易制成含銅化合物。同時硫元素也能夠對細菌表現出良好的抗菌性，因此制備CuS作為抗菌材料受到了研究者們的極大關注[9]。

目前各種方法所制備的CuS微粒均為六方晶型，對于其他晶型CuS的制備及其抗菌效果的研究較少，因此探究不同晶型CuS的抗菌性能具有重要意義。

本研究采用油/水界面法合成CuS微粒，通過改變反應條件，得到不同晶型的CuS微粒，并測試其對金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌（E.coli）的抗菌活性，期望能夠擴大其在生物醫學領域的應用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：氯化銅（CuCl2·2H2O，99.0%，國藥集團化學試劑公司）、油酸鈉（99.0%，國藥集團化學試劑公司）、硫化鈉（Na2S·9H2O，99.0%，國藥集團化學試劑公司）、甲苯（99.0%，國藥集團化學試劑公司）、無水乙醇（99.7%，國藥集團化學試劑公司）；超純水和去離子水為自制。

儀器：Hitachi S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM，日 本 日 立 HITACHI），Rigaku D/max-2500型 X 射線衍射儀（XRD，日本Rigaku），力辰DF-101S型磁力攪拌器(力辰儀器科技有限公司)，Centrifuge5810型高速離心機（德國艾本德股份有限公司），YXQLS-S型全自動高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅生物儀器股份有限公司），SW-CJ-2FD型雙人超凈工作臺（聚創環保設備有限公司），HYG-B型全溫控制搖瓶柜（蘇州培英實驗設備有限公司），9080型隔水式恒溫培養箱（華城敏科實驗儀器廠）。

1.2 樣品的制備

油 酸 銅 的 合 成：將 0.02 mol CuCl2·2H2O 和0.04 mol油酸鈉溶于正己烷、無水乙醇、超純水體積比為3∶4∶7的混合溶劑中，70℃下回流反應4 h，反應結束后置于冰浴中冷至0℃，分離析出物，去離子水與無水乙醇交替洗滌，真空干燥，得到綠色的油酸銅產物。

CuS微粒的合成：將0.004 mol油酸銅溶入100 mL甲苯中，0.004 mol Na2S·9H2O 置于 100 mL 去離子水中溶解并逐滴加入到上述含有油酸銅的甲苯溶液中，置于反應釜中分別在120℃和180℃下反應5 h，待反應結束后，分離、洗滌、60℃真空干燥，分別得到六方相和正交相的球狀CuS微粒。

1.3 樣品的抗菌性測試

實驗選擇兩種菌種，革蘭氏陽性菌S.aureus和革蘭氏陰性菌E.coli。

（1）菌懸液制備：用接種環挑取一個菌落，置于裝有液體培養基的錐形瓶中充分涮洗，錐形瓶封口后置于37℃搖床中培養12 h，稀釋適當倍數。

（2）試樣制備：分別稱取0.01 g不同晶型的CuS粉末于各樣品瓶中，向其中加入4.9 mL的PBS和100 μL的預制菌液。對照組為空白對照，即只加入4.9 mL的PBS和100 μL的預制菌液。將樣品瓶固定在恒溫振蕩培養箱的搖床上，37℃培養12 h。

（3）活菌計數培養：試樣和對照試樣振蕩培養后，適當稀釋，分別取10 μL樣液在3個滅菌平皿中平行接種，待凝固后將上述平板置于恒溫培養基中培養10 h后進行菌落計數，并計算抑菌率C。

式中C為抑菌率，a為對照試樣的平均活菌數，z為待測試樣的平均活菌數。

2 結果與討論

2.1 CuS微粒的XRD表征

圖1為油/水界面法分別在120℃和180℃下反應5 h所制備的CuS微粒的XRD圖譜。從圖中可以看出，在120℃下反應5 h所制備的CuS微粒的衍射峰對應PDF標準卡片06-0464，即在此條件下反應得到的產物是六方相CuS；在180℃下反應5 h所得到的CuS微粒為正交相CuS，其衍射峰則對應正交相CuS的標準PDF卡片65-7111。

圖1 CuS微粒的XRD圖

2.2 CuS微粒的SEM表征

圖2是在120℃和180℃下分別制備的六方相和正交相CuS微粒的SEM圖。由圖可以看出，所制備的六方相CuS為極細的納米片組裝而成的微球顆粒，平均粒徑為1.25 μm，納米片厚度約70 nm，微球表面粗糙、大小均勻；正交相CuS顆粒也是由納米片組裝成的微球顆粒，平均粒徑為1.24 μm，納米片較六方相CuS微球的納米片厚，約130 nm。

2.3 CuS微粒的抗菌性

樣品對S.aureus和E.coli的抗菌試驗結果如圖3、圖4所示。

圖2 六方相CuS微粒（a）和正交相CuS微粒（b）的SEM圖

圖3是S.aureus分別與正交相、六方相CuS微粒接觸10 h后的菌落照片。由圖可以看出，10 h接觸過后，菌落數相較于空白對照組明顯減少，可以說明兩種晶型的CuS微粒對于金黃色葡萄球菌均表現出較好的抗菌性能。

圖3 S.aureus與CuS微粒接觸10 h后的菌落照片

圖4是E.coli分別與正交相、六方相CuS微粒接觸10 h后的菌落照片，從中可以看到，經過10 h接觸，試驗組的菌落數同樣明顯少于空白組，說明兩種晶型的CuS微粒對于E.coli也表現出優異的抗菌性能，尤其是正交相CuS微粒對于E.coli的抗菌效果非常明顯。

圖4 E.coli與CuS微粒接觸10 h后的菌落照片

對樣品抗菌性能定量分析的抑菌率結果統計如圖5所示。從圖5可以看出，油水界面法制備的正交相CuS微粒對S.aureus和E.coli的抑菌率分別為99.6%±1.5%、100%；六方相CuS微粒對S.aureus和E.coli的抑菌率分別為97.4%±4.7%、85.9%±11.1%。

3 結論

本文通過油/水界面法分別在120℃和180℃下成功制備出了結晶性良好的六方相和正交相CuS微粒，均為納米片堆疊而成的微球結構。六方相和正交相CuS微粒對E.coli和S.aureus均具有非常優異的抗菌性能，對于抗菌材料的探索具有一定的意義。

圖5 E.coli和S.aureus與試樣接觸培養10 h后的抑菌率統計