阿魏酸香蘭素發酵條件的優化

邢晨光

（廈門歐米克生物科技有限公司，福建廈門 361000）

香蘭素（Vanillin），又名香草醛，學名4-羥基-3-甲氧基苯甲醛，在秘魯香脂、丁子香芽油、香子蘭、咖啡、葡萄和白蘭地中有發現，具有香子蘭氣味，味甜[1-3]。香蘭素是一種重要的香料，可以作為賦香劑、矯味劑、協調劑、增香劑應用于食品、煙草、日化和農業。因其用途廣泛，每年的需求量以10%的速度增長，但國內產量仍然滿足不了國內外市場需求[4-5]。

香蘭素的生產方法有化學合成法、提取法、生物轉化法和酶法[6]。隨著人們健康意識的提高，天然香蘭素的需求量和價格持續攀高，也成為了近幾年研究的熱點[7]。但是天然香蘭素通過植物提取所得，數量有限，遠遠滿足不了市場的需求，而化學合成法所造成的環境負擔也越來越重，所以生物轉化法和酶法成為生產香蘭素的主力軍[8-9]。

本文采用生物轉化法，以阿魏酸為底物通過微生物代謝而生成香蘭素，周期短、產率高、污染少，經過對發酵條件的優化，已具備工業化條件。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

沙鏈霉菌（Streptomyces psammoticus）OMK-4，保藏于廈門歐米克生物科技有限公司菌種室。

1.2 主要儀器

30 L自動補料發酵罐，上海保興生物科技有限公司；高效液相色譜（HPLC），美國安捷倫，1260Ⅱ；生物傳感器，山東科學院，SBA-40E；分光光度計，島津，UV-1780；pH計，梅特勒，S-210S。

1.3 培養基

1.3.1 種子培養基

可溶性淀粉 1.0～3.5 g/L，磷酸二氫鉀 0.1～0.5 g/L，尿素0.1～0.3 g/L，硫酸鎂0.05～0.10 g/L，碳酸鈣0.1～0.3 g/L，酵母浸粉 0.1～1.0 g/L，玉米漿 0.1～1.0 g/L，硫酸銨0.1～0.6 g/L，阿魏酸 0.2 g/L。

1.3.2 發酵培養基

可溶性淀粉 2.0～5.0 g/L、磷酸二氫鉀 0.1～0.3 g/L、尿素 0.1～0.5 g/L、硫酸鎂 0.05～0.1 g/L、碳酸鈣 0.5～2.0 g/L、酵母浸粉 0.1～1.0 g/L、硫酸銨 0.1～0.5 g/L、阿魏酸 2.0 g/L。

1.4 培養方法

1.4.1 種子培養

在無菌條件下從培養好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環長勢良好的菌株接入無菌種子培養基中，該種子培養基初始pH為5～8，在培養溫度28～35 ℃、轉速200～500 r/min的條件下培養菌體到對數生長期。

1.4.2 發酵罐培養

將培養至對數生長期的種子液在無菌條件下以5%～15%的體積比接入發酵培養基；發酵培養基初始 pH 為 7.2～7.8，在溫度 30～40 ℃、攪拌轉速 200～500 r/min，通氣量 1 ∶ 0.5 的條件下發酵 70～120 h。

1.5 發酵條件優化

1.5.1 pH對香蘭素發酵的影響

發酵過程的pH不僅影響到底物的存在形式，還和細胞的滲透壓有關聯，影響底物進出細胞，為得到最優發酵pH，考察不同的pH控制對香蘭素效價的影響，具體方法為：（1）發酵整個過程的pH控制為7.5；（2）0～12 h控制pH為7.5，后續控制pH為8.0；（3）發酵整個過程pH控制為8.0。

1.5.2 溶氧對香蘭素發酵的影響

實驗證明，發酵液中溶氧的控制對菌體的生長以及后期產物的積累均有較大的影響，因此，需要對發酵過程中的溶氧進行控制。為得到最優的發酵溶氧控制，考察不同的溶氧控制對菌體和產物的積累影響。具體實驗如下：通過轉速和通氣量聯動分別將溶氧控制在0%、10%、20%、30%、40%和50%。

1.5.3 培養溫度對香蘭素發酵的影響

溫度對微生物的生產、代謝產物的合成和積累都有重要的影響作用。溫度升高會加快微生物的生長代謝，但是溫度過高也會導致菌體提前進入衰亡期，影響產物的積累。因此對菌株進行溫度優化具有重要的意義[10]。為得到最優的發酵培養溫度，考察不同的培養溫度對菌體生長的影響，通過控制溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃和 40 ℃來對比菌體生長情況和香蘭素的積累情況，從而獲得最優的溫度控制方式。

1.5.4 接種量對香蘭素發酵的影響

不同的接種量對菌體正常的生長和代謝有重要的影響作用，接種量過小時會導致菌體生長緩慢，菌體生長的延滯期加長，次生代謝產物復雜不利于后期產物的積累；接種量過大會導致菌體過度生長，培養基營養物質損耗加大，溶氧量達不到控制要求[11]。因此控制發酵接種量具有重要的意義。為得到最優的發酵接種量，考察不同的接種量對菌體生長的影響，通過接種量分別為1%、3%、5%、7%和9% 5個梯度來對比菌體生長情況和香蘭素的積累情況，從而獲得最優的接種量。

1.6 分析方法

菌體濃度測定：取培養液用蒸餾水稀釋一定倍數后混勻，在620nm波長下，利用分光光度計測定吸光度。

殘糖測定：采用斐林試劑滴定法進行測定[12]。

香蘭素含量測定：采用HPLC進行檢測[13]。

2 結果與討論

2.1 pH對香蘭素發酵的影響

如圖1所示，在pH為7.5時，菌體生長情況較好，最大OD620為0.62；pH為8.0時菌體生長情況較差，最大OD620為0.41；pH在0～12 h為7.5，后續控制為8.0，最大OD620為0.64。因此，pH為7.5時有助于菌體的生長，pH越高，菌體生長越緩慢。從分段控制pH可以看出，在后期pH調至8.0時菌體生長并沒有受到影響，因此在發酵12 h左右菌體已經基本達到穩定期。

從圖2可以看出不同的pH控制下，香蘭素濃度分 別 為 13.200 g/L、16.988 g/L 和 14.500 g/L；在 0～12 h控制pH為7.5，后續控制pH為8.0時香蘭素轉化率最高，pH為8.0時轉化率次之，pH為7.5時轉化率較差，可能是因為在pH為8.0時酶活要優于pH為7.5時。

綜合圖1和圖2可以總結出菌體在pH為7.5時菌體生長情況較好，在pH為8.0時酶活轉化率較高，因此選擇在發酵過程中進行分段控制有助于菌體的生長并獲得較優的酶活。

圖1 不同pH控制對菌體生長的影響

圖2 不同pH控制對發酵生產香蘭素的影響

2.2 溶氧對香蘭素發酵的影響

從圖3可以看出，隨著溶氧量的不斷增加，菌體濃度越來越大，其中在溶氧量為0%時，菌體生長情況最差，基本不長菌體；在溶氧量在40%～50%時，是菌體最適生長條件，菌體生長至最高，OD620為0.75左右。在溶氧量不斷增加的情況下，菌體進入對數生長期的時間逐漸減小，在溶氧量達到40%～50%時，菌體生長的適應期最短，可以快速進入對數生長期，縮短發酵周期。因此，可以判斷菌體生長需要大量的氧氣供應，在溶氧量為40%～50%時菌體生長情況最佳。

從圖4可以看出，隨著溶氧量的不斷增加，香蘭素的積累量呈現先逐漸上升、再緩慢下降的趨勢；在溶氧量為30%左右時，香蘭素的積累量最佳，最高可以達到17.5 g/L左右；在溶氧量較低時，香蘭素的積累量少可能是因為菌體生產情況不佳，酶量不夠或者低溶氧情況影響了酶活力。隨著溶氧量的逐漸增加，香蘭素的積累量逐漸出現了下降趨勢，特別是在50%溶氧量的情況下，在發酵后期會出現香蘭素減少的情況，在檢測過程中發現副產物香草酸的積累量逐漸增加，懷疑是溶氧量過大導致整個代謝流偏向產生香草酸。因此在產香蘭素的階段，溶氧控制不宜過高，避免影響其整體的轉化率。

綜合圖3和圖4可以看出，在發酵過程中對溶氧的控制選擇分段控制，其中在菌體生長階段溶氧控制在40%～50%，以保證菌體量的積累并縮短菌體生長周期；在發酵產香蘭素階段將溶氧控制在30%左右以保證產物的快速積累。

圖3 不同溶氧量對菌體生長情況的影響

圖4 不同溶氧量對香蘭素轉化量的影響

2.3 培養溫度對香蘭素發酵的影響

從圖5可以看出，溫度較低時菌體生長較為緩慢，隨著培養溫度的升高菌體濃度越來越高，在溫度達到35 ℃左右時，菌體濃度最高，OD620達到0.73；然而，隨著溫度升高至40 ℃，菌體濃度開始降低，可能是因為溫度過高破壞了菌體正常的代謝環境。

從圖6可以看出，隨著溫度的逐漸升高，香蘭素的轉化率越來越高，轉化效果按照大小依次排序為35 ℃、30 ℃、40 ℃和 25 ℃；按照每份菌體轉化效率計算，最適溫度依次為 40 ℃、35 ℃、30 ℃和25 ℃。從中可以看出，隨著溫度的逐漸升高，香蘭素的轉化率越來越高，在較高溫度下，香蘭素的轉化率要優于低溫環境下香蘭素的轉化。

對比圖5和圖6可以看出，溫度對OMK-4菌株發酵轉化香蘭素的影響較大，綜合兩方面的對比，選擇在溫度為35 ℃下進行菌株的培養和香蘭素的轉化。

圖5 不同溫度對菌體生長的影響

圖6 不同溫度對香蘭素轉化的影響

2.4 接種量對香蘭素發酵的影響

從圖7可以看出不同接種量對最終菌體濃度的影響，5種不同的接種量最終均能達到菌濃0.7左右，其中1%的接種效果較差，最高菌濃僅為0.65左右。在前10 h，隨著菌種量的加大，發酵的延滯期明顯縮短，對比1%和9%的接種量，延滯期明顯縮短了6 h左右。從圖8可以看出9%的接種量明顯要差于其他4種接種量，可能是由于在培養過程中菌體主要是在供給與菌體濃度的增加，酶活力相對會減小。因此接種過程中接種量不宜過大。對比1%、3%、5%和7%的接種量，5%的接種量條件下，香蘭素轉化率略高于其他4種，最高轉化量依次為17.21 g/L、17.23 g/L、18.05 g/L 和 17.27 g/L。綜合考慮圖7 和圖8，最終選擇最優的接種量為5%。

圖7 不同接種量對菌體生長的影響

3 結論

30 L自動補料發酵罐優化所得到最佳的發酵條件為：在0～12 h控制pH為7.5、溶氧控制40%～50%，后續控制pH為8.0、溶氧控制30%；發酵溫度全程35 ℃，接種量5%。在最優條件下發酵36 h，香蘭素最終效價高達25.3g/L，取得了較好的中試效果。

圖8 不同接種量對香蘭素積累的影響