鐵錳礦產電菌PseudomonasputidaF04的分離及其產電性能

付彩萍，蔣詠梅，章文賢

（福建師范大學生命科學學院，工業微生物教育部工程研究中心，福建福州 350117）

微生物燃料電池（Microbial fuel cells，MFCs）是一種利用微生物將有機物中的化學能轉化為電能的裝置。其工作原理是微生物分解陽極室中的基質產生電子，電子通過合適的電子介質從胞內轉移至陽極，再通過外電路傳遞至陰極，從而產生電流。由于MFCs能夠將廢棄物中的有機質轉化為電能，有助于同時解決能源短缺和環境污染兩大問題，因而受到廣泛關注[1-2]。

1911年，Potter[3]首次發現微生物在代謝過程中產生電子。產電菌是微生物燃料電池的核心，截至目前已有20多個屬相繼被報道[4]。其中研究較多的有希瓦氏菌屬（Shewanella）、地桿菌屬（Geobacteracae）、紅育菌屬（Rhodoferax）、弧形桿菌屬（Arcobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）以及蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）的菌株[5-6]。產電菌的電子傳遞機制與其種類密切相關，例如S.oneidensise通過自身產生細胞色素作為可溶性電子穿梭介體，這是典型的電子穿梭體介導的間接傳遞機制[7]；Geobactersulfurreducens等微生物利用類似纖毛或菌毛的導電物質，轉移電子至胞外，此為納米導線傳遞電子機制[8]。

進一步研究不同的產電機制有利于提高電子傳遞速率，而新的產電菌具有獨特的生理特性和代謝功能，可在不同的領域發揮作用，如生物傳感器、金屬氧化還原等。因此，新型高效產電菌的分離篩選及生理特性研究具有重要意義。鄭艷等[9]曾利用產電微生物還原磁黃鐵礦中的鐵。常見的電子受體主要有不溶性的鐵/錳氧化物、腐殖質等大分子有機物和MFCs的電極3類，因此，產電菌廣泛分布于鐵/錳氧化物、腐殖質這些富含電子受體的區域及厭氧環境中，如鐵錳礦山、土壤及海底沉積物等。本研究從鐵錳礦樣品中富集篩選具有產電性能的菌株，并對其產電性能進行了初步研究，優化其產電條件。

1 材料與方法

1.1 實驗培養基

菌株 N-N 富集培養基：NH4NO31.0 g/L，NaNO30.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.2 g/L，檸檬酸三鈉 2.0 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.0～7.2。

LB 生長培養基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉 15 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.2。

陽極液采用M9培養基：Na2HPO4·12H2O 17.8 g/L，KH2PO43.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.12 g/L，CaCl20.01 g/L 和碳源；陰極液采用0.1 mol/L鐵氰化鉀溶液：鐵氰化鉀32.92 g/L，KCl 5.6 g/L，Na2HPO4·12H2O 17.8 g/L，KH2PO43.0 g/L。

1.2 菌株分離與鑒定

取鐵錳礦石樣品和陽極溶液組裝電池，待運行穩定后，取少量陽極碳氈生物膜在N-N富集培養基上稀釋涂布、培養。挑取形態差異明顯的單菌落，分離4～5次直至得到純菌株。分別接種至MFCs檢測其產電能力。

選取產電效果較好的MFCs，陽極室的菌液分離純化后送至福州鼎國生物技術有限公司，進行16S rRNA測序鑒定。基因序列在NCBI上BLAST比對并提交序列，選取同源性較高的參比序列，MEGA4.0進行同源序列比對，鄰接法（NJ）構建系統發育樹。

1.3 MFCs組裝與運行

MFCs為有效容積100 mL的雙室電解池，示意圖如圖1所示，Nafion 117質子交換膜中間隔開，陰、陽極碳氈面積2 cm×3 cm，0.5 mm鈦絲作電子集流體，外電阻（R）為1000 Ω。培養12h的菌液離心，菌體接種至陽極液中，使其終濃度OD600為1.0，在磁力攪拌器上室溫下運行。輸出電壓（U）以每分鐘的頻率用信號記錄儀采集系統（MPS-010602）記錄。

圖1 微生物燃料電池裝置示意圖

1.4 電化學活性測試

1.4.1 極化曲線與功率密度曲線

MFCs運行穩定后，斷開電路6～8h，依次連接阻 值 為 50000Ω、10000Ω、5000Ω、2000Ω、1000Ω、800Ω、500Ω、300Ω、200Ω、100 Ω 的電阻，運行30 min，記錄對應外電阻的電壓值U，繪制極化曲線及功率密度曲線。電流密度i和功率密度P根據公式1和公式2的歐姆定律計算獲得，式中S為陽極碳氈的表面積。

1.4.2 循環伏安掃描

分別在陽極室中加入菌體和陽極液、12h培養菌液的上清液，組裝MFCs，使用電化學工作站（CHI1040C）的三電極系統進行完整的循環伏安掃描。其中，工作電極為碳氈、對電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl，掃描速率為0.01 V/s，電位限值為 -0.4～0.4 V，靈敏度為 10-3。

1.5 條件優化

1.5.1 生長培養基對菌株產電性能的影響

采用LB與N-N富集培養基，進行生長能力和產電性能的比較。

1.5.2 陽極液碳源對菌株產電性能的影響

M9陽極液中分別添加2 g/L可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乙酸鈉作為碳源，組裝電池，測定電壓；改變碳源濃度（0 g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L），組裝電池，測定電壓。

1.5.3 陽極液pH對菌株產電性能的影響

將陽極液pH分別調節至4、6、7、8、10，其他條件一致，組裝電池，測定電壓。

2 結果與討論

2.1 產電菌株的分離與鑒定

從運行穩定的鐵錳礦樣品富集MFCs的陽極碳氈中，分離得到4個形態差異明顯的菌株，分別命名為菌株F01，F02，F03，F04，其形態特征與產電能力如表1所示。菌株F04的產電效果最好。

表1 4株菌株的形態特征及產電能力

菌株F04的16S rRNA基因測序結果顯示其序列長度為1428 bp，將該序列提交至GenBank（序列號為MN726711）。BLAST顯示，該菌株分別與Pseudomonas putida strainM9、P.putida strain M7 及P.putida BN-St序 列 的 相 似 性 為 99.79%、99.86%和99.79%，這3個菌株均屬于惡臭假單胞菌。由MEGA4.0構建系統發育樹，如圖2所示，發現該菌株與 P.putida strainM9（KF358272.1）序列同源性達100%，判斷菌株F04為惡臭假單胞菌，將其命名為P.putida F04。

圖2 菌株F04的系統進化樹

2.2 條件優化

2.2.1 生長培養基對菌株F04產電性能的影響

分別在N-N、LB培養基中培養菌株P.putida F04，發現不同培養基對菌株的生長有明顯影響，結果如圖3所示。N-N培養基中，菌株的停滯期與對數期均較短，細胞數量在8 h之后便不再增加，穩定期較長。而在LB培養基中，菌株不僅生長繁殖速度快，且最終OD600達到2.8，是N-N培養基中的3.5倍。

分別取在N-N和LB培養基培養12h的菌體，與陽極液混合（OD600為1）加入陽極室，組裝電池。MFCs在室溫下運行一個周期，結果如圖4所示。發現兩種MFCs均在214 h達到最大電壓，分別為158 mV（N-N）和 167 mV（LB），高于 100 mV 的持續時間分別為 253 h（N-N）和 315 h（LB）。由于兩個MFCs的陽極室中起始菌體數量相同，可見LB培養基中培養的菌株產電性能較好，推測與LB培養基的營養較豐富有關。

圖3 培養基對菌株F04生長曲線的影響

圖4 培養基對菌株F04產電性能的影響

2.2.2 陽極液碳源對菌株F04產電性能的影響

碳源是微生物生長的基礎，MFCs陽極室中的微生物分解碳源產生電子和質子，電子再經陽極至陰極的傳遞產生電流。因此，碳源的種類和含量差異會導致微生物的代謝途徑和氧化還原反應發生變化，進而影響電子產生的快慢及產量的高低，最終影響MFCs的產電性能[10]。

不同碳源對P.putida F04產電性能的影響見圖5。以乙酸鈉作為碳源時，MFCs的輸出電壓極低且長時間低于20 mV。然而，Kim[11]在培養G.sulfurreducens時，只有乙酸作為碳源時菌株才生長且最高功率密度為13～16 mW/m2。可見碳源種類會對產電菌的適應性產生顯著性影響。

以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作為陽極液碳源時，MFCs產電較高，均達到100 mV以上；以葡萄糖為碳源的MFCs在60 h即可達到最大輸出電壓119 mV，用時最短；以可溶性淀粉為碳源的MFCs產電最高，294 h 電壓達到 198 mV；以蔗糖作為碳源的 MFCs，93 h內電壓達到189 mV。以葡萄糖、可溶性淀粉和蔗糖為碳源的MFCs的電壓維持高于100 mV的時間分別為17h、53h和275 h。以上結果與3種碳源的相對分子質量和結構相對應，葡萄糖為單糖，能直接被微生物利用，因此達到最高電壓的速度較快，但維持高電壓的時間短。可溶性淀粉的分子結構較復雜，需要水解成小分子物質，才能被微生物代謝，故而達到最大電壓值的時間較長。蔗糖為二糖分子，被微生物分解為果糖和葡萄糖，產電速率快，在52 h后蔗糖MFCs電壓便遞增，產電量較高。綜合最大輸出電壓和產電速率考慮，將蔗糖作為P.putida F04產電的碳源進行后續研究。

在陽極液中加入不同濃度的蔗糖作為碳源，如圖6所示，MFCs電壓隨蔗糖濃度的增大而上升。陽極液中碳源濃度為0時，MFCs幾乎不產電；蔗糖濃度為2 g/L時，菌株輸出電壓在69 h升高至最大輸出電壓152 mV；8g/L蔗糖時菌株在后期稍有下降。整體來看，4 g/L蔗糖作為碳源，菌株的產電效果較好，最大電壓達到217 mV。

圖5 碳源種類對菌株F04產電性能的影響

圖6 碳源濃度對菌株F04產電性能的影響

2.2.3 陽極液pH對菌株F04產電性能的影響

pH對微生物的生長具有極大影響，在MFCs中，陽極的pH值通過改變陽極液中的離子濃度、細胞內的酶活性和細胞膜所帶電荷的狀態，從而導致產電菌的底物代謝速率、產生電子的多少及生物膜的形成發生變化[12]。

將陽極液調至不同pH，運行MFCs，輸出電壓見圖7。與 Tremouli[12]和 S.Veer Raghavulu[13]的結果類似，在中性環境下，P.putida F04產電性能最好，陽極液pH為7時，MFCs的最大輸出電壓為266 mV，且產電能力最為穩定；pH為8時，最大輸出電壓為180 mV，高于pH為6時最大輸出電壓的1.5倍，可見菌株P.putida F04更適應偏堿性環境，而偏酸性環境不利于其產電。由于強酸、強堿會破壞生物大分子的穩定性，影響細胞酶活性，不利于菌體的生長，導致陽極碳氈的生物膜難以形成，因而陽極液pH為4和10時，MFCs產電量極低。

圖7 不同pH的MFCs輸出電壓

2.3 極化曲線和功率密度曲線

極化曲線和功率密度曲線是描述MFCs電化學性能的重要判斷方法。隨著外電阻減小，電流密度增大，外電壓減少，功率密度先上升后下降[14]。當外阻與內阻相同時，面積功率密度最大，故通過功率密度曲線可獲得MFC的內阻值[15]。

4 g/L蔗糖為碳源的MFCs的極化曲線與功率密度曲線見圖8。開路電壓為564mV，整體看來，電流密度與外電壓之間呈線性相關，但區域1偏移擬合曲線，電壓急劇下降，這是因電極氧化還原反應、細胞膜與電極間的電子傳遞過程造成的能量損失，引起的活化內阻。區域2電壓二次降低，是因電極底物的消耗速率和底物的補給速率不同引起的傳質內阻[16]。功率密度曲線中，電流密度為956 mA/m2，最大面積功率密度為 181.8 mW/m2，此時外電阻為 1000 Ω，由此判斷，微生物燃料電池內阻為1000 Ω。

表2是菌株F04與首次被報道典型產電菌的產電性能的對比。為便于比較，面積功率密度單位統一為mW/m2。在已發現的產電菌中，以乳酸鹽為碳源的Shewanellaoneidensis DSP10和以乙酸鹽為碳源的Rhodopseudomonaspalustris DX-1的面積功率密度最高，分別為 3000mW/m2、2720 mW/m2，其他菌株面積功率密度多在30～400 mW/m2。經初步條件優化，菌株P.putida F04 產電面積功率密度達到 181.8 mW/m2。

2.4 循環伏安掃描

產電菌的氧化還原性是MFCs運行的關鍵。產電菌產生電子介質，將氧化還原過程中產生的電子傳遞到胞外的產電機制，是目前最具說服力的產電機理。而循環伏安法（cyclic voltammetry，CV）是用來檢測微生物中是否有電子介質的常用方法[28]。

為進一步研究菌株P.putida F04的產電機制，將菌體和陽極液、上清液各進行了一次完整的循環伏安掃描，結果見圖7。菌體和陽極液在-0.071 V、-0.270 V有明顯的氧化峰和還原峰，而上清液未出現氧化還原峰，這表明傳遞電子的介質可能存在于菌體中。

圖7 菌株F04的循環伏安曲線

3 結論

（1）本研究從鐵錳礦樣品中富集分離得到1株產電能力較強且運行穩定的菌株，鑒定并命名為P.putida F04。

圖8 極化曲線與功率密度曲線

（2）菌株的生長培養基、陽極液的碳源和pH等參數對菌株P.putida F04的產電性能有較大影響。LB培養基有利于菌株生長；乙酸鈉不利于MFCs產電；以葡萄糖為碳源時，MFCs在60 h內達到最大電壓119 mV；以可溶性淀粉為碳源，MFCs高于 100 mV持續時間長，而在4 g/L蔗糖濃度陽極液下，菌株的產電速率較快且最大輸出電壓較高。菌株在中性環境下產電能力最強，最高可達到266 mV，酸性、堿性環境不利于產電。

表2 初次報道的產電菌的產電能力

（3）以4 g/L蔗糖為碳源時，菌株F04最大面積功率密度達181.8 mW/m2，內電阻為 1000 Ω。循環伏安掃描分析表明，傳遞電子的介質可能存在于菌體中，但具體的產電機制仍有待進一步研究。