穩(wěn)定性同位素氘標記蘇丹紅I-D5的均勻性分析

蔡銀萍

(濱州職業(yè)學院，山東 濱州 256600)

均勻性是標準物質最基本的屬性之一，是標準物質制備過程中的關鍵要素。為了檢驗樣品是否均勻，通常隨機抽取一定數量的樣品，采用精密度高的實驗方法，對抽取的樣品在同樣的實驗條件下進行測定，從而使樣品間的差異完全由樣品本身的不均勻性反映出來[1-2]。

根據國家標準物質技術規(guī)范的要求：候選物應滿足適用性、代表性，以及容易復制的原則[2]。候選物的均勻性的量值范圍應適合該標準物質的用途。對于分裝成的最小包裝單元的標準物質必須進行均勻性檢驗，同時抽取的單元數目對樣品的總體要求要有足夠的代表性，抽取的單元數取決于總體樣品的單元數和對樣品均勻程度的了解。

1 檢驗方法及判斷依據

按照《標準樣品工作導則(5)：化學成分標準樣品技術通則》(GB/T15000.5-94)對所研制的標準品均隨機抽取n瓶，以其中一瓶作為基本比對點，其余n-1瓶作為檢驗點，采用相應的數理統(tǒng)計方法對各標準品的均勻性進行檢測和研究。采用F檢驗法和t檢驗法聯(lián)合進行均勻性檢驗。

所研制的蘇丹紅-I-D5標準品分裝成5 mg/瓶，共344瓶。

隨機抽取15瓶樣品，任選其中一瓶作為基本對比點，連續(xù)進行14次測試(14次樣品轉化，平行測定)；其余14瓶作為檢查點，每瓶各測試一次(平行轉化與測定)；分別計算平均值和方差，以F檢驗法和t檢驗法聯(lián)合進行均勻性的檢驗。

用F檢驗法檢驗所取樣本方差的顯著性差異，有下列判斷公式：

式中：S12―數值較大的方差；S22―數值較小的方差；ν1，ν2分別為計算S12和S22的自由度，本課題組取ν1=ν2=14-1=13；Fα(ν1，ν2)―給定顯著性水平α及自由度(ν1，ν2)的統(tǒng)計檢驗的臨界值，查表Fα(13，13)=2.58，當滿足判定公式(1)時，則兩組的方差不存在顯著性差異。

用t檢驗法檢驗兩組的平均值是否存在顯著性差異，有下列判斷公式：

將式(3)和式(4)代入式(2)，整理得

當滿足(5)式時，則兩組平均值不存在顯著性差異。若F檢驗法和t檢驗法的檢驗結果不存在顯著性差異，則說明該標準物質是均勻的。

2 實驗方法

2.1 抽樣方法

2.2 抽樣方式

按隨機數表抽取樣本，去除重復和無用的，抽取15瓶蘇丹紅-I-D5樣品號為：3,24,56,97,117,132,140,147,167,227,234,244,258,299,327。將其編號為：S1,S2,S3,S4,S5,S6,S7,S8,S9,S10,S11,S12,S13,S14,S15。

2.3 檢驗項目

本標準物質有2個特征值：含量(質量分數%)和D的同位素豐度(mol%或atom%)。

檢驗項目2個：①采用高效液相色譜對所研制的標準物質的含量進行檢測，外標法定量；②分別采用電噴霧質譜儀和氣體同位素質譜計對蘇丹紅-I-D5的同位素豐度進行測定。

記錄結果，以F檢驗法和t檢驗法檢驗蘇丹紅-I-D5的2個特性量值的均勻性，結果見表1～6。

2.4 檢驗用儀器與色譜/質譜條件[3-4]

用液相色譜法檢驗其純度；用電噴霧質譜儀檢驗其同位素D(2H)的豐度(mol%或atom%)。

蘇丹紅-I-D5的化學純度分析方法：高效液相色譜儀，型號：高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(HPLC：日本島津LCMS-2020)；色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm (I.D.)，5 m，GL Sciences lnc)；流動相A：0.3%甲酸的水溶液∶丙酮=3∶1；流動相B：乙腈；A∶B=25∶75；進樣量：10 L；柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1，分流器分流0.8 mL·min-1；特征波長： =478 nm；流動相A、B按比例混勻(A∶B=25∶75)，配置濃度為0.5，1，2，5和10 g·mL-1的標準分析液。進行HPLC外標法分析，繪制標準曲線并求出對應關系式。

蘇丹紅-I-D5的同位素豐度分析方法：采用TSQ Quantum Access 高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質譜聯(lián)用儀 (美國，Themo Scientific公司)分析氘標記的同位素豐度。電噴霧電壓：4 kV；調諧濾鏡電壓：70 V；干燥氣流量：10 L·min-1；霧化氣流量：4 L·min-1；加熱模塊溫度：350℃；脫溶劑管溫度：250℃；單掃描時間：0.1 s；蠕動泵流速：10μL·min-1；掃描模式：負離子模式；掃描范圍：m/z=([M-H]- 10) dalton=(242～262) dalton；譜圖疊加次數：> 20；平行實驗次數：3次。

3 蘇丹紅-I-D5的化學純度的均勻性分析

在本實驗中，選擇S10作為對比組，其他的作為檢測組。

表1、表2為蘇丹紅-I-D5的化學純度的檢測結果，表3為蘇丹紅I-D5的化學純度檢驗結果的F檢驗法和t檢驗法的統(tǒng)計檢驗結果。

表1 對比組純度檢驗結果

表 2 檢驗組純度結果

表3 數理統(tǒng)計檢驗結果

表3(續(xù))

在顯著性水平α=0.05，檢測組和對比組的自由度均為13的情況下(F0.05(13，13)=2.58，t(0.05,26)=2.056)，純度結果的測定方差無顯著性差異，測定平均值無顯著性差異。1系列圖表說明蘇丹紅-I-D5的化學純度均勻性良好。

4 蘇丹紅-I-D5的同位素豐度的均勻性分析

在本實驗中，選擇S10作為對比組，其他的作為檢測組。

表4、表5為D同位素豐度的檢測結果，表6為D同位素豐度檢驗結果的F檢驗和t檢驗的統(tǒng)計檢驗結果。

表4 檢驗組同位素豐度結果

表5 對比組同位素豐度結果

表6 數理統(tǒng)計檢驗結果

在顯著性水平α=0.05，檢測組和對比組的自由度均為13的情況下(F0.05(13，13)=2.58，t(0.05,26)=2.056)，D同位素檢驗結果的測定方差無顯著性差異，測定平均值無顯著性差異。2系列圖表說明氘同位素豐度均勻性良好。

5 結果與討論

蘇丹紅-I-D5標準物質為紅色固體純品，以電噴霧質譜儀對其同位素豐度特性值進行檢驗、以高效液相色譜儀(HPLC)對其含量特性值檢驗合格后，在干燥、潔凈的分裝實驗室進行分裝。經HPLC和MS對兩種標準物質的特性值進行均勻性檢驗和穩(wěn)定性監(jiān)測，結果顯示：均勻性良好，并通過F和t檢驗。