皂角苷對銅綠假單胞菌降解土壤PAHs的影響

楊 倫，吳智勇，陳靈澤，胡凱璐，孫超男，張 棟

(杭州電子科技大學 材料與環境工程學院 環境科學與工程系，浙江 杭州 310018)

多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)具長期污染、生物蓄積及“三致”效應，1976年美國環保署率先將16種PAHs列為優先控制污染物，也是我國優先控制的68 種污染物之一。PAHs污染土壤會導致土壤功能受損，危害人和生態安全，急需有效修復[1]。微生物修復因成本低、效果好、二次污染少等優點備受關注[2]，但PAHs生物有效性低，限制了微生物修復的應用[3-4]。生物添加和增效試劑強化是提高微生物修復效率和程度的有效途徑[5-6]，但目前其作用機制、界面過程調控及其聯合作用，均尚不清楚。因此，本文以銅綠假單胞菌和皂角苷為降解菌和表面活性劑代表，研究了銅綠假單胞菌對PAHs的降解和吸附性能，探明了皂角苷對土著微生物降解和銅綠假單胞菌添加后PAHs去除效果的影響，探討表面活性劑對生物添加增效修復PAHs污染土壤的影響。

1 實驗

1.1 材料

芘純度>95%，菲、苊純度97%，皂角苷純度BR，均購自上海阿拉丁試劑有限公司；萘純度99%，購自上海麥克林生化科技有限公司；主要試劑理化性質見表1。

表1主要試劑理化性質

1.2 實驗方法

液相降解：向500 mL滅菌三角瓶中加入350 mL滅菌無機鹽培養基，含1.0 mg·L-1菲、106CFU·mL-1銅綠假單胞菌和系列濃度皂角苷(0～4 CMC)。在25℃，150 r/min恒溫振蕩14 d，每2天取樣分析菌體生長、菌體表面疏水性、液相及菌體菲的含量。

吸附：稱取5 mg失活菌體于22 mL樣品瓶內，加入20 mL系列PAHs溶液(含0～4 CMC皂角苷)，25℃ 150 r/min恒溫振蕩，離心分離后測定上清液中污染物的濃度。

土壤降解：稱取1.5 g污染土壤于22 mL樣品瓶，加入20 mL系列皂角苷溶液(0～4000 mg·L-1)，25℃ 150 r/min恒溫振蕩7 d，測定土壤中污染物的濃度。

1.3 分析方法

PAHs采用高效液相色譜儀(Agilent 1260)測定，配PAHs專用色譜柱(4.6×250 mm)，流動相為甲醇/水混合(95∶5,v/v)；熒光檢測器檢測波長見表1。生物量采用比濁法測定600 nm吸光度OD600[3]。細胞疏水性(cell surface hydrophobicity,CSH)利用吸附法測定[7]，取4 mL清洗復懸菌液(濃度記OD600,i)至8 mL樣品瓶，加入1 mL正己烷，渦旋混合20 s后靜置30 min，取水相測定OD600,f，按下式計算細胞疏水性。

2 結果與討論

A: 生長量和菲濃度; B:吸附-降解率和細胞疏水性

圖1 銅綠假單胞菌對菲的吸附-降解

圖2 假單胞菌對PAHs的等溫吸附系數與PAH性質的關系

研究了銅綠假單胞菌對溶液中菲的吸附-降解性能，如圖1。假單胞菌可以菲為唯一碳源生長，OD600在第3天達到0.412。隨時間增加，碳源逐漸減少，細菌數量開始下降，第15天OD600降到0.214。同時，CSH逐漸減小，由第1天的31.2%降低至第15天的4.7%。銅綠假單胞菌對菲的利用表現為顯著的先吸附后降解，這與文獻報道一致[3-4]。吸附率在第3天已經達到平衡，維持在12.9%～16.3%；細菌對菲降解率在第15天達到77.9%。

研究了銅綠假單胞菌對PAHs的吸附性能，細菌對4種PAHs的吸附均表現出較好的線性，主要以分配作用為主，其吸附系數(Kd)依次為1564.9、1706.8、10786和12668 L·kg-1，與PAHs的疏水性(logKow)呈顯著正相關(logKd=0.66logKow+0.892，如圖2)，與文獻報道規律一致[8-9]。

A:細菌生物量；B:菲濃度

圖3顯示了皂角苷對銅綠假單胞菌吸附菲的影響，皂角苷增大了菌體對菲的吸附量。菌體CSH只有4.7%(圖1B)，表現為相當強的親水性，皂角苷分子由親水端與細菌表面結合，將疏水端暴露在外，從而提供了額外的疏水分配相[4]。

研究了皂角苷對土壤PAHs降解的影響，如圖4，低濃度(100 mg·L-1以下)皂角苷促進了菲和芘的去除，而高濃度皂角苷抑制其降解。生物添加銅綠假單胞菌后，并未表現出促進降解或對皂角苷有更好耐受性。進一步研究了皂角苷對銅綠假單胞菌降解菲的影響(圖5)，可以看出低濃度皂角苷(4 CMC，即140 mg·L-1以下)基本上降低了細菌的生長量，也降低了細菌對菲的降解，主要是表面活性劑-PAHs復合物、自身或增溶毒性導致[10-12]。結果說明，雖然銅綠假單胞菌具有良好的吸附、降解PAHs性能，但土壤微生物的競爭以及皂角苷的毒性作用，導致其并不能在土壤中發揮作用，因此，在實際土壤修復中添加專性降解菌是需要慎重考慮的。

3 結論

本文發現銅綠假單胞菌可高效降解溶液中菲(可達77.9%)，假單胞菌對PAHs的吸附系數與PAHs的logKow呈線性正相關(logKd=0.66logKow+0.892)。低濃度皂角苷(100 mg·L-1以下)可增加土壤中菲和芘的降解，但會抑制銅綠假單胞菌的生長和降解PAHs能力。銅綠假單胞菌加入土壤中并不會促進土壤PAHs的降解，也沒有顯示出對高濃度皂角苷的耐受性，生物添加法在實際應用中需慎重考慮。