針對(duì)不同濃度范圍的接觸性DNA比較幾種常見純化方法

吳 婷，朱洪建 ，陳瑤清，文佳樂，吳喬丹

(1.湖南警察學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410138；2.岳麓公安分局刑事科學(xué)技術(shù)室，湖南 長(zhǎng)沙 410006)

接觸性DNA(Touch DNA)是指通過(guò)皮膚接觸而遺留在客體表面的DNA，主要來(lái)源于人體脫落細(xì)胞[1]。當(dāng)前公安實(shí)戰(zhàn)中，現(xiàn)勘人員提取到的接觸類檢材越來(lái)越多，而接觸類檢材樣本中DNA含量很少，且存在大量PCR抑制劑，使得這類檢材檢出成功率很低。通過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)研究，我們建立了應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)提取接觸性DNA的孵育條件[2]，為本研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究對(duì)目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室常用的接觸性DNA提取純化方法進(jìn)行初步的比較,旨在探索針對(duì)不同濃度范圍的接觸性DNA能有效提高檢測(cè)成功率與準(zhǔn)確性的純化方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及來(lái)源

10 ng/μLDNA標(biāo)準(zhǔn)品：本實(shí)驗(yàn)室。抗-DNA多克隆抗體免疫膠體金凍干粉劑：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。滅菌純水：屈臣氏。5% Chelex-100溶液：本實(shí)驗(yàn)室。EZ1 DNA Tissue試劑盒：QIAGEN公司。10 ng/μL蛋白酶K溶液:本實(shí)驗(yàn)室。TES緩沖液：本實(shí)驗(yàn)室。PCR反應(yīng)試劑：PowerPlex21試劑盒，Promega公司。

電泳試劑：Hi-DiTM 甲酰胺(AB公司)；PPlex21 Allelic Ladder(Promega公司);CC5 ILS500(Promega公司)。

1.2 主要儀器

恒溫混勻儀Thermomixer comfort：德國(guó)Eppendorf。5424小型臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。多用途高速臺(tái)式離心機(jī): 美國(guó)Thermo公司。微量振蕩器：廣州IKA公司。 微量移液器：Gilson。BioRobot EZ1提取工作站：德國(guó)QIAGEN公司。PCR9700擴(kuò)增儀：美國(guó)ABI公司。3130xl Genetic Analyzer：美國(guó)ABI公司。Microcon 100超濾管:美國(guó)Millipore公司。

1.3 針對(duì)不同濃度范圍的接觸性DNA比較幾種常見純化方法

(1) 抗-DNA多克隆抗體免疫膠體金溶液的配置：取免疫膠體金凍干粉劑，加滅菌純水溶解，配置成濃度為0.4 mg/mL的免疫膠體金溶液備用。

(2)模擬接觸性DNA溶液的制備：取DNA標(biāo)準(zhǔn)品2800M(10 ng/μL)加入相應(yīng)比例的滅菌純水分別制成終濃度為0.05 ng/μL的DNA溶液備用。

(3)分組：在建立了免疫膠體金技術(shù)針對(duì)接觸性DNA的孵育條件后，為了進(jìn)一步研究免疫膠體金技術(shù)針對(duì)接觸性DNA的提取純化能力，設(shè)計(jì)了這部分實(shí)驗(yàn)。為了模擬接觸性DNA的特點(diǎn)，將濃度為0.05 ng/μLDNA標(biāo)準(zhǔn)品2800M按樣本中DNA含量分為A-G 7組,并進(jìn)行10組平行試驗(yàn)，即A組0.025 ng、B組0.05 ng、C組0.1 ng、D組0.2 ng、E組0.5 ng、F組1ng和G組5 ng，分別配制成實(shí)驗(yàn)用液各200 μL，即：

A組(0.025 ng):取濃度0.05 ng/μL DNA溶液0.5 μL，終濃度為0.000125 ng/μL；

B組(0.05 ng):取濃度0.05 ng/μL DNA溶液1 μL，終濃度為0.00025 ng/μL；

C組(0.1 ng):取濃度0.05 ng/μL DNA溶液2 μL，終濃度為0.0005 ng/μL；

D組(0.2 ng):取濃度0.05 ng/μL DNA溶液4 μL，終濃度為0.001 ng/μL；

E組(0.5ng):取濃度0.05 ng/μL DNA溶液10 μL，終濃度為0.0025 ng/μL；

F組(1 ng):取濃度0.05 ng/μL DNA溶液20 μL，終濃度為0.005 ng/μL；

G組(5 ng):取濃度0.05 ng/μL DNA溶液100 μL，終濃度為0.025 ng/μL。

(4)抗DNA多克隆抗體免疫膠體金法：采用200 μL體系，往樣本組中加入純水補(bǔ)足體系，然后分別加入5 μL免疫膠體金，室溫下振蕩孵育15 min，13000 r/min離心10 min，吸棄上清，留沉淀，取2.5 μL沉淀，直接用于PCR反應(yīng)。剩余沉淀存放于4℃冰箱。

(5) EZI法：采用200 μL體系，往樣本中加入G2緩沖液、10 μL PK補(bǔ)足體系，震蕩混勻，置于恒溫混勻儀中56℃下1 h；后取出于100℃加熱8 min；13000 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一0.5 mL離心管中，棄沉淀；使用EZ1 DNA Investigator Kits進(jìn)行樣品處理，使用BioRobot EZ1 工作站進(jìn)行DNA提取和純化，洗脫液選項(xiàng)：水溶液、50 μL。提取液待擴(kuò)增。

(6)Mirocon 100超濾法：采用200 μL體系，往樣本中分別加入純水補(bǔ)足體系并混勻；將Microcon 100超濾管分別套在產(chǎn)品隨帶的1.5離心管中，將上述樣本分別加入到4個(gè)超濾管內(nèi)；室溫25℃ 500 g離心12 min；去掉1.5 mL離心管，將超濾管反轉(zhuǎn)套在另一干凈的1.5 mL離心管中；室溫25℃ 1000 g離心3 min，膜上的DNA回收到離心管中待擴(kuò)增。

(7)Chelex-100法：采用200 μL體系，往樣本中分別加入 5% Chelex-100溶液、6 μL PK補(bǔ)足體系；置于恒溫混勻儀中56℃下1 h；后取出于100℃加熱8 min；13000 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一0.5 mL離心管中待擴(kuò)增，棄沉淀。

(8)PCR擴(kuò)增：使用GeneAmp PCR System 9700型擴(kuò)增儀(AB公司)和PowerPlex21試劑盒(Promega公司)。PCR反應(yīng)液(4×模板)；引物混合物(2×Primer，2×Mix)；去離子水(2×water)。進(jìn)行30次循環(huán)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃，1 min，循環(huán)0次；94℃，10s，59℃，1 min，72℃，30 s，30次循環(huán)；60℃，10 min，4℃，forever。其余操作過(guò)程按照試劑和儀器說(shuō)明書進(jìn)行。

(9) 擴(kuò)增產(chǎn)物檢驗(yàn)：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL加入8 μL甲酰胺和2 μL ILS500(Promega公司)經(jīng)熱變性后，使用3130XL Genetic Analyzer(ABI公司)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用Genemapper軟件進(jìn)行分析，得出等位基因分型。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)后得到DNA圖譜的觀察比較，結(jié)果如表1。

表1 針對(duì) A-G組四種純化方法DNA檢測(cè)結(jié)果的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)針對(duì)F-G范圍內(nèi)四種純化方法DNA 檢測(cè)結(jié)果，免疫膠體金法、Mirocon100法效果相當(dāng)，EZI法次之，但均優(yōu)于Chelex-100；針對(duì)A-E范圍內(nèi)四種純化方法DNA 檢測(cè)結(jié)果，免疫膠體金法>Mirocon100法> EZI >Chelex-100；針對(duì)B-E范圍內(nèi)，除免疫膠體金法外，EZI法、Mirocon100法、Chelex-100法均不理想；針對(duì)A-B范圍內(nèi),不含B，四種純化方法均不理想；

(2)免疫膠體金技術(shù)針對(duì)不同濃度范圍的接觸性DNA的提取純化效果明顯優(yōu)于EZI法、Mirocon100法、Chelex-100法。因此，在F-G范圍內(nèi)的接觸性DNA選用免疫膠體金法/Mirocon100法,或Chelex-100/EZI+免疫膠體金法；在A-E范圍內(nèi)可選用免疫膠體金與其他方法聯(lián)合。

3 結(jié)論與不足

3.1 結(jié)論

本研究應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)針對(duì)不同濃度范圍的模擬接觸性DNA的提取純化效果明顯優(yōu)于EZI法、Mirocon100法、Chelex-100法。抗-DNA多克隆抗體標(biāo)記膠體金制備成的免疫膠體金，用于模擬接觸性DNA的提取，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短，且實(shí)驗(yàn)始終在同一管內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，減少了微量檢材樣本在多次轉(zhuǎn)移過(guò)程中造成的損耗，節(jié)省人力成本的同時(shí)降低了實(shí)驗(yàn)耗材成本。

3.2 不足

關(guān)于針對(duì)提取純純化方法的比較。本研究只對(duì)目前國(guó)內(nèi)公安法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室常用的提取純化方法進(jìn)行了初步的比較，且樣本容量設(shè)置仍然偏低，由于時(shí)間、經(jīng)費(fèi)以及實(shí)驗(yàn)條件等因素的限制，沒能進(jìn)行PCR實(shí)時(shí)定量來(lái)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，沒能采納國(guó)際先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法加入比較，實(shí)驗(yàn)的模擬樣本條件設(shè)置也過(guò)于單一，希望以后能進(jìn)一步充實(shí)相關(guān)研究。