正交試驗優化葡萄籽總黃酮提取工藝

田 歡，張雨鑫，成超超，胡選生

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

葡萄籽富含豐富的氨基酸、維生素和礦物質，具有較高的營養和藥用價值[1-4]。黃酮是一類大量存在于植物中的天然有機化合物，具有調節內分泌、清除人體中超氧離子自由基、延緩衰老、增強機體免疫力、抗心腦血管疾病、抗炎鎮痛、抑菌抗病毒等多種生理活性[5-6]，本研究以葡萄籽為原料，利用正交試驗探究乙醇溶劑浸提法提取葡萄籽總黃酮的最佳工藝條件，為葡萄籽的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

葡萄籽：回收于商洛學院生物醫藥與食品工程學院教學及新品酒研發過程中產生的葡萄籽；蘆丁標準品購于西安晶博生物科技有限公司; 無水乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鹽酸、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純。

1.2 主要試驗儀器

BJ-300多功能粉碎機(浙江德清拜杰電器有限公司)；LGJ-10D型冷凍干燥機(北京四環科學儀器廠有限公司)；DHG-9123A型恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司)； RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業有限公司)；UV-1100型紫外可見分光光度計(上海美析儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制

分別移取0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL蘆丁標準液并將其置于25 mL容量瓶中，先加0.3 mL 5%的NaNO2溶液搖勻靜置6 min，再加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液搖勻靜置15 min，加4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，最后用80%乙醇定容至標線，(得濃度為0.01～0.05 mg/mL蘆丁溶液)，用可見分光光度計(λ=510 nm)測定吸光度值，以吸光值為縱坐標，蘆丁標準液濃度為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線[7]。

1.3.2 毛酸漿總黃酮提取率的測定

根據蘆丁標準曲線計算樣品中總黃酮的質量濃度，通過下式計算提取率。

(1)

式中：C-葡萄籽總黃酮的質量濃度，mg/mL；N-稀釋倍數；V-樣品液體積，mL；M-樣品質量，g。

1.3.3 提取毛酸漿總黃酮單因素實驗

以葡萄籽總黃酮的提取率為指標，液料比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度為考察因素，選擇料液比 (1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30) 、乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)、提取時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、提取溫度(50、60、70、80、90、100℃)進行單因素試驗。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

以蘆丁濃度(mg/mL)為x軸、吸光度(A)為y軸作標準曲線(圖1)。

圖1 蘆丁標準曲線

由圖1可知線性回歸方程為：Y=20.04X+0.012，R2=0.9989。

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對葡萄籽總黃酮提取率的影響

料液比對葡萄籽總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對葡萄籽總黃酮提取率的影響

結果表明：葡萄籽中總黃酮的提取率先增大后減小，當料液比達到1∶10時，提取率最大，當料液比大于1∶10，提取率開始下降。在物料一定的情況下，料液比過低，總黃酮不易擴散至提取溶劑中。而過高的料液比則由于在反應已充分的情況下，沒有起到提高提取率的作用，而且還會增加溶劑成本，不利于后續操作。

2.2.2 乙醇濃度對葡萄籽總黃酮提取率的影響

圖3 乙醇濃度對葡萄籽總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對葡萄籽總黃酮提取率的影響見圖3。結果表明，總黃酮提取率隨著乙醇濃度的升高而增大，當乙醇濃度為60%時，提取率最大，繼續增加乙醇濃度，葡萄籽中總黃酮含量降低，根據相似相溶原理，極性相似可達到最大溶出度，當乙醇濃度達到60%時，溶劑與溶質極性較為相似，可達到最佳提取狀態。并且在一定范圍內，乙醇濃度超過一定值時，會使色素等雜質溶出量增加，不利于黃酮的提取。

2.2.3 提取時間對葡萄籽總黃酮提取率的影響

圖4 提取時間對葡萄籽總黃酮提取率的影響

提取時間對葡萄籽總黃酮提取率的影響見圖4。當提取時間低于2.5 h時，由于在一定時間內，反應時間的增加有利于黃酮類物質與有機溶劑反應，提取率增加；當提取時間高于2.5 h時，由于提取超過一定時間，其他化合物質的溶出會影響黃酮類物質的提取率，同時黃酮類物質因暴露時間過長而與空氣發生氧化，大大降低提取效果，提取率下降。

2.2.4 提取溫度對葡萄籽總黃酮提取率的影響

提取溫度對葡萄籽總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對葡萄籽總黃酮提取率的影響

隨著提取溫度的升高，在80℃處提取率最大，之后提取率下降，原因可能為加熱溫度過高導致原料內部的分子結構受到損害，影響提取效果。

2.3 葡萄籽總黃酮提取正交試驗

2.3.1 正交試驗因素水平設計

由單因素實驗結果可知：料液比為1∶5～1∶15，乙醇濃度為50%～70%，提取時間為2～3 h，提取溫度為70～90℃時，總黃酮的提取率達到最大值。綜上分析，確定正交試驗中的實驗因素及水平，具體見表1。

表1 提取工藝正交試驗因素水平設計

2.3.2 正交試驗結果及分析

表2 正交試驗結果表

由表2可知，葡萄籽總黃酮提取率的影響因子由大到小依次為：料液比>提取溫度>提取時間>乙醇濃度。根據極差分析，較優水平為：A2B2C2D2, 即料液比1∶10、乙醇濃度60%、提取時間2.5 h、提取溫度80℃。

由于本實驗極差分析的較優水平A2B2C2D2與九組正交中較優組合A2B3C1D2不一致。在此條件下，平行實驗3次，進行驗證試驗，結果見表3。

表3 正交結果驗證試驗

由表3可知，在A2B2C2D2條件下總黃酮提取率高于A2B3C1D2。因此得到最佳工藝參數為A2B2C2D2，即料液比1∶10、乙醇濃度60%、提取時間2.5 h、提取溫度80℃。

3 結論

通過對葡萄籽總黃酮提取工藝條件的研究，在料液比為1∶10、乙醇濃度為60%、提取時間為2.5 h、提取溫度為80℃時，葡萄籽總黃酮提取率最大，最大提取率為1.1321%。