探究早期兔膝骨關節炎中ERK信號通路對細胞自噬的作用

師婕，張鈺，許秀峰，胡麗芳，趙巧珍，陳琛，黃丹，李錦，陳煥，陳立早

骨關節炎(Osteroarthritis,OA)是一類好發于中老年人的慢性退行性骨關節病變[1-3]。在多種物理及生化因素的刺激下，金屬蛋白酶、II型膠原和蛋白聚糖等細胞外基質的滲出增多，引起軟骨結構的退變，由此誘發骨關節炎的典型表現[4-6]。中晚期骨關節炎的病理過程不可逆，因此目前研究者專注探索早期骨關節炎的治療方法[7]。近年來，細胞自噬被認為能抑制骨關節炎中某些蛋白的形成，如金屬蛋白酶3(Metalloproteinase-3，MMP-3)、活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)、白細胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)等，因此在骨關節炎以及其他年齡相關的疾病中，細胞自噬的激活減弱可能為其重要因素之一[8-12]，這啟發了研究者們靶向調節細胞自噬很可能成為一種新型治療骨關節炎的方法。UNC-51樣激酶1(UNC-51-like Kinase 1,ULK1),Beclin1和微管相關蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3,LC3)是細胞自噬中的關鍵蛋白，其中我們認為ULK1是啟動者，Beclin1是調控者,LC3是執行者。

研究發現，細胞外調節蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)信號轉導通路對細胞自噬具有調控作用[13-16]，但小鼠睪丸支持細胞系中，致癌物質林丹介導的ERK信號通路卻抑制了自噬的發生。因此，不同疾病中ERK信號通路對細胞自噬的作用不一致。本研究首次探索骨關節炎中ERK信號通路對細胞自噬的作用，并進一步明確ERK信號通路的作用機制。本研究方案采用ERK信號通路抑制劑U0126行雙膝關節腔注射的方式，以兔為研究對象，探索ERK途徑在骨關節炎中對MMP3和細胞自噬的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取24只4個月齡的健康新西蘭雄性大白兔為研究對象，平均體重2kg左右，隨機分為3組，對照組、OA組和OA+U0126組，每組8只。

1.2 對照組 不接受任何干預措施；OA組和OA+U0126組予以連續3d雙膝關節腔注射0.1ml 4%的木瓜蛋白酶造模；OA組于造模后15d處死；OA+U0126組：造模7d后；予以0.1ml 100umol/ml的ERK抑制劑U0126連續3d雙膝關節腔注射，于造模后15d處死。

1.3 評定標準 ①大體觀察:觀察實驗前后每組兔子毛色的光澤度及體重變化，造模處局部有無紅腫發熱及壞死，每組兔子自由活動情況和生命體征等。切取雙膝股骨內側髁進行肉眼觀察：關節軟骨色澤是否暗淡，表面是否光滑，有無增厚、壞死及粘連；滑膜有無增生、粘連；關節液的色澤、量；關節腔內有無粘連等變化。②組織學觀察：取每組實驗兔雙側股骨內側髁關節面軟骨為實驗標本，給予4%多聚甲醛固定并至脫鈣完全。隨后行常規石蠟包埋和連續病理切片，分別進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin Staining，HE)染色、甲苯胺藍及番紅-固綠染色，光鏡下觀察軟骨的形態變化、細胞簇集及排列是否整齊、基質染色及軟骨表面裂隙及纖維化等情況。通過甲苯胺藍染色半定量分析糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)。采用雙盲法按國際骨關節炎研究學會(Osteoarthritis Research Society International，OARSI) 軟骨病理變化評分標準[17]。OARSI評分根據HE和番紅-固綠染色，計算分期(0～4期)*分級(0～5級)的總分來評價OA嚴重程度。且OARSI評分小于12分被定義為骨關節炎早期；OARSI分級為1級時，關節軟骨即有早期退變。OARSI評分的分數越高，則說明骨關節炎病變越嚴重。③蛋白免疫印跡：按蛋白免疫印跡法測定樣品中的蛋白濃度，經電泳、轉膜、封閉、一抗、二抗敷育以及ECL顯色曝光后，通過圖像分析軟件IPP6進行灰度分析檢測空白對照組、OA組和OA+U0126組中MMP3、磷酸化的ERK(P-ERK)、ULK1、自噬相關蛋白Beclin1和LC3II/LC3I的灰度值。

2 結果

2.1 大體觀察 3組兔子實驗前后的體重以及體重的變化各組兩兩比較差異無統計學意義，見表1。對照組軟骨表面光滑較薄，色澤明亮，未見裂隙，觸之較硬；關節滑膜未見增生和水腫等；關節液無滲出。OA+U0126組與對照組比較，軟骨色澤稍暗，膝關節軟骨表面稍增厚，關節內滑液明顯增多。OA組軟骨增厚變粗糙最明顯，滑液最多。

表1 3組兔子的體重比較

2.2 關節軟骨光鏡下觀察 OA組明顯可見軟骨表面增厚出現裂隙，軟骨細胞增生，細胞基質失染以及細胞排列紊亂和簇集等典型骨關節炎改變。OA+U0126組軟骨增厚、細胞增生排列紊亂等改變比OA組輕。見圖1，2，3。實驗后，OA+U0126組和OA組GAG含量均低于對照組(均P<0.05)；OA+U0126與OA組比較，GAG含量升高(P<0.01)。OA+U0126組和OA組OARSI評分均明顯高于對照組(均P<0.05)；OA+U0126組與OA組比較，OARSI評分降低(P<0.01)。見表2。

2.3 蛋白免疫印跡 實驗后,OA+U0126組和OA組 P-ERK、MMP3含量較對照組均升高(均P<0.05)，LC3II/LC3I、ULK1和Beclin1含量較對照組均降低(均P<0.05)。OA+U0126組與OA組比較，P-ERK、MMP3含量均降低(均P<0.05)，LC3II/LC3I、ULK1和Beclin1含量均升高(均P<0.05)。見圖4和表3。

表2 3組兔實驗后GAG含量與OARSI評分比較

與對照組比較，aP<0.05；與OA組比較，bP<0.01

表3 3組蛋白免疫印跡結果比較

與對照組比較，aP<0.05；與OA組比較，bP<0.05

圖1 甲苯胺藍染色 (倍數:10×10)

圖2 HE染色(倍數:10×10)

圖3 番紅-固綠染色(倍數:10×10)

圖4 3組蛋白免疫印跡檢測結果比較

3 討論

OARSI評分系統在2016年進一步修改，將分級細化，增加了0.5分、1.5分、2.5分、3.5分及4.5分等區間[18]。根據新版OARSI評分以及我們之前的研究結果, 木瓜蛋白酶造模后15d，軟骨OARSI評分接近12分，可作為早期骨關節炎的臨界點。因此，本實驗設計在木瓜蛋白酶造模15d時將新西蘭大白兔處死，取股骨內側髁軟骨標本進行研究。研究結果中，每組OARSI評分均小于12分，證實本實驗成功建立了早期骨關節炎模型，而OA+U0126組中OARSI評分較OA組減少，差異具有統計學意義，提示膝關節腔注射ERK抑制劑U0126可部分逆轉骨關節炎病理改變。

MMP3作為OA的標記蛋白之一，與軟骨細胞的退變密切相關。ERK信號通路激活后發生磷酸化，可參與細胞的增殖分化生長等，當ERK過度激活時，可抑制細胞增殖及凋亡。本研究中，蛋白免疫印跡結果可見，ERK抑制劑U0126經膝關節腔注射后，OA+U0126組中MMP3含量比OA組低；組織學觀察發現，OA+U0126組中軟骨表面侵犯、軟骨細胞退變等病理改變比OA組輕，該結果支持前人對ERK信號通路在骨關節炎中作用的結論，證實了ERK信號通路在早期骨關節炎中對MMP3有調節作用，ERK抑制劑U0126可減少MMP3的形成，減少關節軟骨退變，抑制軟骨細胞凋亡，從而減緩OA的發展。反向證明了ERK信號通路可加重骨關節炎改變，而且其作用機制與促進MMP3的生成密切相關。

本研究通過ERK抑制劑U0126行兔膝關節腔注射來觀察細胞自噬的作用，發現U0126抑制后，自噬相關蛋白Beclin1、ULK1和LC3II/LC3I均明顯升高。Beclin1, ULK1和LC3II/LC3I分別于自噬的成核階段和延長階段起關鍵作用。成核階段，在內質網和高爾基體中，哺乳類動物關鍵蛋白mTOR通過與ULK1復合物(ULK1、Atg13、Atg101和FIP200組成)相互作用，將細胞外刺激信號整合成自噬特異性信號，然后Beclin1激活與VPS34和VPS15相組合成復合體，通過與多種自噬相關蛋白結合，從而誘導自噬體的形成。延長階段，LC3前體LC3I被自噬蛋白Atg4B迅速切割，被Atg7激活后，與Atg3和Atg5-Atg12-Atg16復合物連接起來，形成了具有能與自噬體膜相結合能力的LC3II，從而識別細胞器。隨后自噬體繼續發育成熟，與溶酶體相融，形成自噬溶酶體并最終降解。 本實驗結果證明了ERK抑制劑U0126對細胞自噬的激活作用貫穿于整個自噬過程，ULK1的改變提示U0126很可能在細胞自噬的成核階段即產生了作用，加強了信號傳導，激活了更多Beclin1，吞噬了凋亡的軟骨細胞器和細胞碎片并最終將其清除。由此，反向證明了ERK信號通路在早期骨關節炎中可抑制細胞自噬作用，從而加重骨關節炎。

本研究通過抑制ERK信號通路，檢測細胞自噬3個不同階段的關鍵蛋白發現，細胞自噬很可能在成核階段即受到ERK信號通路的調控作用,可減輕早期OA的病理改變。而本研究為動物實驗，可完善體外試驗進一步證實研究結論。今后研究將詳細探究ERK信號通路對細胞自噬的具體作用機制，以及影響骨關節炎發生發展、影響細胞自噬的其他因素，從而為探索骨關節炎的治療方案提供新思路。