稀土鑭對(duì)鐵皮石斛不定芽誘導(dǎo)、植株生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物合成的影響

苗永美 童 元 方 達(dá) 王宇豪

（安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院，鳳陽(yáng) 233100）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，也是我國(guó)傳統(tǒng)珍惜名貴中藥材之一。古代醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作中均有記載，鐵皮石斛在道家經(jīng)典《道藏》被譽(yù)為“中華九大仙草”之首。鐵皮石斛味甘、性微寒，具生津養(yǎng)胃、滋陰清熱、潤(rùn)肺益腎、明目強(qiáng)腰、抗腫瘤及提高免疫力等功效［1］。

野生鐵皮石斛主要分布在安徽、浙江、福建、云南等地，生于海拔1 600 m 的山地半陰濕的懸崖峭壁處或長(zhǎng)滿青苔的巖石或樹上，喜歡空氣濕度大、冷涼環(huán)境。鐵皮石斛野生資源急劇減少，分別于1987 和1992 年被列為“三級(jí)保護(hù)品種”和“瀕危植物”。利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖種苗后進(jìn)行人工栽培已在安徽、江蘇、浙江等省份開展的如火如荼，但種植鐵皮石斛需要模擬原生境高投入，且管理精細(xì)。鐵皮石斛的離體無性繁殖技術(shù)己基本成熟，包括叢苗的繁殖、壯苗生根、原球莖誘導(dǎo)增殖、懸浮培養(yǎng)等；開展的研究主要集中在基本培養(yǎng)基選擇、激素優(yōu)化、有機(jī)附加物的添加、活性炭的使用等方面［2］。此外，鐵皮石斛成分積累影響因素如光質(zhì)［3］、培養(yǎng)方法［4］、栽培生長(zhǎng)環(huán)境［5～6］、內(nèi)生菌［7～8］等研究也有少量報(bào)道。根據(jù)作者近年來研究和文獻(xiàn)報(bào)道，鐵皮石斛離體繁殖中仍然存在不定芽誘導(dǎo)率低、植株生長(zhǎng)緩慢及促進(jìn)植株生長(zhǎng)和藥用成分合成的誘導(dǎo)子研究不夠全面等問題。稀土尤其是鑭元素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常用，有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成及提高抗逆等功能。研究表明，硝酸鑭能促進(jìn)細(xì)莖石斛生長(zhǎng)［9］，也能促進(jìn)鐵皮石斛組培苗生長(zhǎng)及提高酶活性［10］；鐵皮石斛盆苗噴施鑭溶液能促進(jìn)光合、增強(qiáng)抗逆和提高多糖及石斛堿含量［11］。鐵皮石斛有效成分主要有多糖、生物堿、菲類化合物、聯(lián)芐、酚酸、黃酮等［12］。目前，鑭在鐵皮石斛上的研究相對(duì)單一，對(duì)產(chǎn)物的種類研究少，對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響未見報(bào)道。本試驗(yàn)在鐵皮石斛不同離體培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中添加硝酸鑭來研究鑭對(duì)不定芽分化、植株生長(zhǎng)及4種代謝產(chǎn)物合成的影響，并進(jìn)行相關(guān)性分析。為后期鐵皮石斛細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)和高產(chǎn)、高品質(zhì)栽培奠定理論基礎(chǔ)和提供技術(shù)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛無菌苗從六安市西山生物技術(shù)有限公司購(gòu)買，在本實(shí)驗(yàn)室繼代擴(kuò)繁得到大批組培苗。

1.2 方法

1.2.1 莖段培養(yǎng)的La3+處理

組培苗經(jīng)繼代擴(kuò)繁后，選取健壯、粗細(xì)基本一致的莖條，節(jié)處切開，形成兩端帶節(jié)的單莖段，接種在添加硝酸鑭的M1（MS+6-BA 0.6 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1）上，使La3+濃度為0、30、50、70、90、110、130、150μmol·L-1，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶6個(gè)莖段，3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)芽數(shù)、稱芽苗鮮重。

1.2.2 組培苗生長(zhǎng)期的La3+處理

選擇粗壯、大小基本一致的鐵皮石斛從苗稱初始鮮重，計(jì)Fw1，接入添加硝酸鑭的M2（MS+6-BA 0.25 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1）上，使La3+濃度為0、30、50、70、90、110、130、150 μmol·L-1，每處理4瓶。3 個(gè)月轉(zhuǎn)接1 次，培養(yǎng)6個(gè)月后測(cè)葉綠素含量；稱鮮重，計(jì)Fw2；去根和葉后稱鮮重，計(jì)Fw3；烘干稱干重，計(jì)Dw；測(cè)干品中多糖、黃酮、總酚和聯(lián)芐含量。

以上培養(yǎng)基需添加1 g·L-1的活性炭、100 g·L-1土 豆 汁、30 g·L-1蔗 糖、7.5 g·L-1瓊 脂 粉，pH=6.5～7.0。光 照 時(shí) 間 為12 h·d-1，光 照 強(qiáng) 度 為40μmol·m-2·s-1，溫度25±2℃。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 莖段培養(yǎng)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

培養(yǎng)3 個(gè)月后，計(jì)數(shù)出芽的莖段數(shù)和總芽數(shù)，稱芽苗的鮮重，根據(jù)公式計(jì)算出芽率、平均芽數(shù)，平均鮮重。

1.3.2 叢苗培養(yǎng)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

叢苗培養(yǎng)6 個(gè)月后，隨機(jī)抽取10 株，用SPAD-502PLUS葉綠素儀測(cè)量第二葉的SPAD，測(cè)3次，均值為該葉片的葉綠素含量；根據(jù)公式Fw2/Fw1 計(jì)算增重倍數(shù)；去葉和根后的鮮條70℃烘15 h 得干品，根據(jù)公式Dw/Fw3計(jì)算干鮮比。

1.3.3 4種次生代謝產(chǎn)物含量測(cè)定

干品研磨，過60 目篩。精密稱取樣品0.5 g，加30 mL 蒸餾水，90℃水浴提取3 h，按照苗永美等［13］方法得樣品多糖液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多糖含量（mg·g-1）。樣品0.5 g，加30 mL 70%乙醇，70℃加熱回流2 h，離心，得上清液，用于黃酮、酚酸和聯(lián)芐含量的測(cè)定。總黃酮含量測(cè)定以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉—硝酸鋁法［14］；總酚酸含量測(cè)定以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚法［14］；聯(lián)芐類物質(zhì)的測(cè)定以石斛酚為對(duì)照品，按照賈芳等方法［15］用紫外分光光度法測(cè)定，得回歸方程A=15.511C（mg·mL-1）+0.003 7。活性成分測(cè)定每處理做3組平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Excel 2010 和SPSS19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析和Duncan 新復(fù)極差法比較分析稀土鑭對(duì)鐵皮石斛不定芽誘導(dǎo)、組培苗生長(zhǎng)和4種成分合成的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度La3+對(duì)莖段出芽及生長(zhǎng)的影響

本研究結(jié)果（見表1）表明，30～150μmol·L-1的La3+能促進(jìn)鐵皮石斛莖段不定芽的分化及芽苗生長(zhǎng)，50μmol·L-1處理上其誘導(dǎo)率最高，顯著高于其他處理。芽數(shù)這項(xiàng)指標(biāo)更能綜合說明培養(yǎng)效果。La3+濃度在70～90 μmol·L-1時(shí)萌發(fā)形成的芽較多（2.78～2.83 個(gè)），顯著高于其他處理。50～90μmol·L-1的La3+促進(jìn)芽苗生長(zhǎng)的效果顯著，每瓶鮮重在3.97～4.16 g。莖段培養(yǎng)目的是為了獲得更多的芽苗，且長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)壯，根據(jù)這一評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為添加70～90 μmol·L-1的La3+對(duì)莖段不定芽誘導(dǎo)和生長(zhǎng)效果最好。

2.2 不同濃度La3+對(duì)叢苗生長(zhǎng)的影響

由圖1 看出，隨La3+濃度升高，葉綠素含量先逐漸升高后降低，但只有130 μmol·L-1的La3+處理上的植株其葉綠素含量與對(duì)照差異顯著，含量為70.2 SPAD，比對(duì)照提高了9.76%。

不同濃度La3+對(duì)鐵皮石斛叢苗生長(zhǎng)的影響見表2，鑭處理下鮮重都有所增加，其中，110～130μmol·L-1La3+處理上植株增重倍數(shù)較大，顯著高于對(duì)照組，其中110 μmol·L-1時(shí)增重倍數(shù)最高，為15.22，比對(duì)照提高了107.64%；110μmol·L-1的La3+最有利于鐵皮石斛干物質(zhì)的積累，干重/鮮重比（以下簡(jiǎn)稱干鮮比）為12.05∶100，對(duì)照提高了64.39%。

表1 La3+添加量對(duì)莖段離體培養(yǎng)的影響Table 1 Effects of La3+concentration on culture in vitro of stem segments

圖1 La3+添加量對(duì)植株葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of La3+concentration on chlorophyll content

表2 La3+添加量對(duì)生物量的影響Table 2 Effects of La3+concentration on plants biomass

2.3 不同濃度La3+對(duì)4種代謝產(chǎn)物含量的影響

鐵皮石斛干品中4 種代謝產(chǎn)物含量的變化見表3。一定濃度的La3+有利于多糖、黃酮、酚酸和聯(lián)芐的合成，30～110μmol·L-1La3+處理上其多糖合成能力顯著高于對(duì)照，110μmol·L-1處理上其多糖含量最高，為98.84 mg·g-1，比對(duì)照提高了27.96%；超過130 μmol·L-1時(shí)，多糖合成受到顯著性的抑制。隨La3+濃度的升高，黃酮、酚酸和聯(lián)芐含量均出現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，90μmol·L-1處理上3種成分含量最高，分別為4.31，7.56 和21.01 mg·g-1，比對(duì)照顯著提高了41.31%，13.35%，73.35%。

表3 La3+添加量對(duì)4種代謝產(chǎn)物含量的影響Table 3 Effects of La3+concentrationon the contents of 4 metabolites

2.4 指標(biāo)的相關(guān)分析

由表4可知，葉綠素含量?jī)H與聯(lián)芐含量的相關(guān)性顯著，與其他5 個(gè)指標(biāo)相關(guān)性不顯著；增重倍數(shù)與干鮮比、聯(lián)芐含量之間的相關(guān)性都達(dá)到顯著水平；干鮮比與4種代謝產(chǎn)物含量相關(guān)性都不顯著；4種產(chǎn)物含量之間相關(guān)性顯著的有多糖與酚酸、總黃酮與總酚、總黃酮與聯(lián)芐。根據(jù)相關(guān)系數(shù)的平均值，每項(xiàng)指標(biāo)與其他6項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性從大到小依次為：聯(lián)芐含量＞總黃酮含量＞干鮮比＞增重倍數(shù)＞多糖含量＞總酚含量＞葉綠素含量。

表4 指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficient analysis of Indexes

3 討論

稀土在植物土培、水培或組培等領(lǐng)域都有應(yīng)用，可以施加到栽培基質(zhì)中，也可噴施到植株上。植物組織培養(yǎng)過程中添加合適濃度的稀土有促進(jìn)組培苗分化、生長(zhǎng)、愈傷組織形成、再分化及改善品質(zhì)的作用，已被廣泛應(yīng)用到藥用植物離體培養(yǎng)［9～11，16～18］。不同植物所需的稀土種類、濃度和添加時(shí)間不盡相同，可能是由于不同植物不同時(shí)期的酶活性、細(xì)胞分泌等功能受金屬離子的影響不同。因此，植物增產(chǎn)、改善品質(zhì)所需的稀土濃度需不斷摸索。作者在進(jìn)行長(zhǎng)期的鐵皮石斛組培中發(fā)現(xiàn)，石斛苗生長(zhǎng)緩慢，繼代周期3 個(gè)月。前期研究還表明鐵皮石斛莖段離體培養(yǎng)中，存在出芽部位要求特殊及外植體易褐化死亡等問題，往往在節(jié)處形成芽點(diǎn)而節(jié)間極難出芽，采取的措施是在節(jié)處切割形成兩端帶節(jié)點(diǎn)的培養(yǎng)物，即便如此，莖段不定芽誘導(dǎo)率仍然很低、芽數(shù)少。本試驗(yàn)采用培養(yǎng)基中添加硝酸鑭的方式研究La3+的作用，表明70～90μmol·L-1的La3+能顯著促進(jìn)莖段不定芽的形成和生長(zhǎng)。130μmol·L-1的La3+能顯著提高組培苗葉綠素含量，植株在含110μmol·L-1La3+培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，鮮重增加顯著，干物質(zhì)增加最多，張桂芳研究表明30～40 mg·L-1的硝酸鑭能明顯提高鐵皮石斛組培苗鮮重、株高等，明顯降低分蘗數(shù)，10～40 mg·L-1的硝酸鑭能顯著提高葉綠素含量［10］；鐵皮石斛盆苗噴施20 mg·L-1的氯化鑭后葉綠素含量比對(duì)照提高了54.37%［11］；培養(yǎng)基中添加15 mg·L-1硝酸鑭處理組的霍山石斛與對(duì)照組長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)，隨濃度增加，側(cè)芽高度和增殖倍數(shù)受到抑制［19］；當(dāng)然也有稀土對(duì)葉綠素影響不明顯的研究報(bào)道，如硝酸鑭對(duì)細(xì)莖石斛葉綠素含量影響差異不顯著［9］。本研究相關(guān)性分析表明葉綠素含量與植株生長(zhǎng)量呈正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著，說明植株的生長(zhǎng)還有可能是因La3+激活了其他生理指標(biāo)的改變，如有研究指出La3+在促進(jìn)了鐵皮石斛生長(zhǎng)的同時(shí)，也提高了植株SOD 酶、CAT 酶和根系活力［12］。另有研究指出稀土對(duì)紫草的促生也與酶活的提升有關(guān)系［18］；但有研究表明La3+是通過與細(xì)胞壁的結(jié)合以改變細(xì)胞的通透性來增加細(xì)胞對(duì)部分營(yíng)養(yǎng)離子的吸收，也可能是通過刺激細(xì)胞有絲分裂使生物量增加［20～21］。

近年來，鑭在提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物合成方面研究取得了較大進(jìn)展，如在東北紅豆杉細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)期加入5.8μmol·L-1的鑭可促進(jìn)紫杉醇合成和釋放［22］；鑭亦能顯著促進(jìn)掌葉大黃毛狀根的生物量和蒽醌［23］及人參毛狀根皂苷［24］的合成。然而稀土鑭對(duì)石斛品質(zhì)的改善研究較少，徐曉燕等用20 mg·L-1的氯化鑭噴施鐵皮石斛盆苗30 d后，葉和莖稈中可溶性蛋白、脯氨酸、多糖含量和石斛堿含量都比對(duì)照有了增加，改善了品質(zhì)［11］。本試驗(yàn)180 d 的La3+處理改善了鐵皮石斛品質(zhì)，但不同代謝產(chǎn)物的合成需要不同濃度La3+誘導(dǎo)，多糖合成需要的最佳濃度為110 μmol·L-1，黃酮、酚酸和聯(lián)芐合成的最佳La3+濃度處理是90 μmol·L-1，3種醇提物中，鑭對(duì)聯(lián)芐的代謝強(qiáng)度提升幅度最大，黃酮次之，酚酸最小。調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成所需鑭濃度因植物和產(chǎn)物而異，促進(jìn)代謝物合成的機(jī)理也因代謝產(chǎn)物和途徑而異［20～24］。人參皂苷積累中是因La3+促進(jìn)了皂苷合成中鯊烯合成酶（PgSS）和達(dá)瑪烯二醇合成酶（PgDDS）的表達(dá)，而對(duì)β-香樹素合成酶（Pg βAS）合成無明顯影響［24］；丹參毛狀根中，La3+通過直接誘導(dǎo)丹參酮類和酚酸類生物合成代謝關(guān)鍵酶基因來提升其含量［25］；而La3+和Ce3+提高懷槐懸浮細(xì)胞中黃酮含量是通過改變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，進(jìn)而間接影響苯丙氨酸裂解酶的表達(dá)來調(diào)控黃酮合成［26］。關(guān)于La3+促進(jìn)鐵皮石斛4 種代謝產(chǎn)物合成的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

葉綠素是植物光合作用的主要色素，葉綠素含量越高，光合能力就越強(qiáng)，植物生長(zhǎng)也就越好。本研究表明，鑭處理的鐵皮石斛其生長(zhǎng)與葉綠素變化相關(guān)性不顯著，代謝物中只有聯(lián)芐與葉綠素相關(guān)性顯著，說明鑭元素是通過改變了其他理化指標(biāo)而促進(jìn)了生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成。根據(jù)相關(guān)系數(shù)的平均值看出聯(lián)芐和黃酮含量與其他5 個(gè)指標(biāo)受稀土鑭調(diào)控變化較為一致，且受鑭調(diào)控影響較大，這兩種代謝產(chǎn)物可作為下一步開展鑭調(diào)控下應(yīng)用生產(chǎn)或機(jī)理研究的主要目標(biāo)產(chǎn)物。