中國主栽櫻花的分子系統發育分析

付 濤 王志龍* 林樂靜 林 立 李 文 袁冬明

（1. 寧波城市職業技術學院/浙江園林綠化技術協同創新中心，寧波 315100；2. 寧波市鄞州區林業技術管理服務站，寧波 315100）

櫻花為櫻屬（Cerasus）植物栽培品種的統稱，經過幾百年的培育，已有幾百個品種，目前國內主栽的櫻花大多數是日本品種，很多景區、公園、學校、街道甚至是家庭都有日本櫻花的種植，最常見的有染井吉野櫻（俗稱早櫻）和關山櫻（俗稱晚櫻），然而，有許多品種親本來源不明、種系定位不一、命名不規范等諸多問題，不利于櫻花產業的健康發展［1～3］。我國擁有豐富的野生資源，遠超日本和朝鮮等國家［4］，然而我國重視食用櫻桃的栽培，對具有觀賞性的櫻屬植物關注甚少，育成品種更少，但近幾年國內“櫻花熱”持續升溫，對自主櫻花品種的培育也在如火如荼地進行中，依托我國豐富的野生資源（我國約50 種櫻屬植物），不久的將來，將會擁有一大批具有我國自主知識產權的櫻花新品種，逐漸將日本品種替換成我國自主栽培櫻花品種［5］。

日本人Kawasaki 將日本櫻花分為7 個群，得到了國際社會的一致認可，但對于雜交或來源不明的品種分類和鑒定有一定的局限性［6～7］。國內南京林業大學王賢榮團隊提出了櫻花品種分類的五級標準，但該標準易受生長環境、栽培管理、砧木選擇等因素的影響，其應用也受到一定的影響［8］。因此，單純依靠形態分類很難將所有品種正確分類，需要借助分子手段加以輔助鑒定。目前，DNA 條形碼廣泛應用于動植物的分類鑒定研究［9～17］，并取得了很好的結果，其中核DNA 序列ITS 和葉綠體DNA 序列rbcL、matK 以及psbA-trnH應用比較多，但rbcL 和matK 為葉綠體功能基因，序列變異較小，因此主要應用于屬及以上水平的分類鑒定研究，而ITS 和psbA-trnH 主要由非功能基因構成，序列變異相對較大，因此可應用于種及種以水平的分類鑒定研究［18-19］。本研究利用ITS和psbA-trnH 對國內引進的櫻花品種進行測序分析，探究彼此間的分子差異，構建系統發育樹，旨在為日本櫻花的分類和種系定位以及糾正形態學分類的不足甚至錯誤提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2016～2017年從寧波、武漢和上海等地采集了88個櫻花品種樣品，采集不同品種櫻花的健康、無病害的幼葉，硅膠處理，4℃保存，詳細樣品信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Samples information and source of the 88 cherry blossoms

續表1Continued table 1

續表1Continued table 1

1.2 方法

利用試劑盒（上海萊楓生物科技有限公司）進行88個樣品的總DNA提取，提取的DNA稀釋后放入冰箱-20℃保存、備用。

選用核基因ITS和葉綠體基因trnH-psbA 進行DNA條形碼分析，2個DNA片段引物序列詳見表2。PCR 反應體系為50μL，其中含預混合液25μL，模板DNA 1μL，引物對4μL，最后補加ddH2O 20μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55或58℃退火30 s（ITS 為58℃；trnH-psbA 為55℃），72℃延伸1 min，45個循環；最后72℃延伸7 min。擴增完成后直接取5μL PCR產物進行點樣，進行瓊脂糖凝膠電泳（1.5%），驗證擴增結果，之后將有目標條帶的PCR擴增產物送到測序公司進行測序。

表2 DNA條形碼引物名稱及其序列Table 2 Primer names and sequences of DNA barcoding

1.3 數據分析

在NCBI 中搜索有關櫻屬植物的ITS 和trnHpsbA 的全長，以此作為標準序列，再將測序得到的序列運用DNAman 軟件與標準序列進行比對，以確認測序的準確性，然后對合格的序列進行修剪，獲得完整的片段序列。利用MEGA 6.0 軟件計算出88 份材料的ITS 和trnH-psbA 各基因序列的組成、G+C 含量（%）等，此外還計算了各序列中的堿基的變異位點率和信息位點率以及轉換/顛換比率等，并通過2 000 次重復的bootstrap 值來確定每個分支的支持率，構建鄰接樹（NJ），選擇K2-P 模型遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 88 個櫻花品種ITS 和trnH-psbA 序列特點分析

由表3可知，ITS序列長度在605～606 bp，變異很小，其中僅有寒緋櫻、才力櫻、大漁櫻、橫濱緋櫻和陽光櫻的ITS 序列長度為605 bp，其余品種ITS序列長度皆為606 bp。trnH-psbA序列長度在288～306 bp，其中內里櫻trnH-psbA 序列長度為289 bp，江戶彼岸櫻、染井吉野櫻、小松乙女櫻、神代曙櫻、澳博拉大葉早櫻、咲耶姬櫻、御帝吉野櫻、陽春櫻、白花真櫻、赤實大島櫻、寒緋櫻和鵯櫻trnH-psbA序列長度為296 bp，陽光櫻trnH-psbA 序列長度為306 bp，其余品種trnH-psbA序列長度均為288 bp。

由表3 還可知，ITS 的G+C 平均百分含量較高（59.6.%），而trnH-psbA 的G+C 平均百分含量卻較低（21.8%）；ITS 和trnH-psbA 的保守位點百分含量相差不大（分別為94.6%和94.5%），而變異位點百分含量相差較大，其中ITS 為5.3%（簡約信息位點為3.3%，單突變位點為2.0%），而trnH-psbA 僅為2.0%（簡約信息位點為0.7%，單突變位點為1.3%），ITS 的簡約信息位點百分含量顯著高于trnH-psbA；ITS插入/缺失序列最少，僅為1個堿基，而trnH-psbA 高達19 個堿基；此外，ITS 轉換/顛換比率為0.7，而trnH-psbA卻為0。

2.2 88個櫻花品種變異位點分析

88 個櫻花品種通過ITS 序列比對得到32 個變異位點，其中簡約信息位點有20個，單突變位點有12 個。通過trnH-psbA 序列比對得到6 個變異位點，其中簡約信息位點有2 個，單突變位點有4個。由表4 可知，ITS 變異位點中有18 個是顛換，有14個是轉換，顛換要高于轉換，其中顛換中A 突變成C、C 突變為A 和G 突變成T 出現頻率相對較高，轉換中G 突變成T 出現頻率較高。trnH-psbA 的6 個變異位點都是顛換，無轉換。由此說明88 個櫻花品種的ITS 的變異程度明顯高于trnH-psbA，ITS 的分辨率要明顯高于trnH-psbA，ITS可作為櫻花品種系統發育研究、品種鑒定等的核心條形碼，而trnH-psbA可作為輔助序列予以應用。

2.3 88 個櫻花品種ITS 和trnH-psbA 插入/缺失序列分析

本研究共得到ITS 的排列位點607 個，在排列位點437 處，寒緋櫻含有1 個單堿基（G）的插入。trnH-psbA 有307 個排列位點，在41～58 排列位點處，陽光含有18 個堿基（CTTGTAAGTTTATCATTA）的插入；在51～58 排列位點處，澳博拉大葉早櫻、白花真櫻、赤實大島櫻、寒緋櫻、江戶彼岸櫻、染井吉野櫻、神代曙櫻、小松乙女櫻、咲耶姬櫻、鵯櫻、陽春櫻和御帝吉野櫻含有8 個堿基（TATCATTA）的插入，此外，在202 排列位點處，內里櫻含有1個單堿基（A）的插入。

表3 序列堿基組成及變異率Table 3 Sequence base composition and mutation rate

表4 變異位點分析Table 4 Analysis of variable

圖1 基于ITS+trnH-psbA組合序列構建88個櫻花品種的NJ樹Fig. 1 The NJ tree of the 88 cherry blossoms with the concatenated ITS+trnH-psbA sequencesT

2.4 88個櫻花品種的系統發育分析

利用分析軟件MEGA 6.0 構建了88 個櫻花品種的系統發育樹（見圖1），由圖1 可知，88 個櫻花品種可分為4 大類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ），其中第Ⅰ類有Ⅰa、Ⅰb 和Ⅰc 三小類，Ⅰa 包含市原虎尾櫻、朱雀櫻、雨宿櫻、伊豆櫻、一葉櫻、維多利富士櫻、太白櫻、手弱女櫻、十月紅櫻、三島富士櫻、嘉獎櫻、紅玉錦櫻、八重紅大島櫻、阿麗亞娜富士櫻、澳博拉大葉早櫻、郁金櫻、內里櫻、白雪櫻、紅豐櫻、雨晴枝垂櫻、駿河臺香櫻、十月櫻、松前紅緋衣櫻、奈良八重櫻和仙臺屋櫻，Ⅰb 包含白山2 號櫻和大島櫻，Ⅰc 包含白妙櫻、赤實大島櫻、大提燈櫻、花笠櫻、蘭蘭櫻、普賢象櫻、松月櫻、御車返櫻和御帝吉野櫻；第Ⅱ類有Ⅱa 和Ⅱb 兩小類，Ⅱa 含有梅護寺數珠掛櫻、旭山、朝日山櫻、山櫻枝垂櫻、福祿壽櫻、大村櫻、紅笠櫻和紅時雨櫻，Ⅱb 含有菊垂櫻、潘多拉櫻、冬櫻、關山櫻、弘前三段咲櫻、紅葉櫻、蝴蝶櫻、麒麟櫻、苔清水櫻和天川櫻；第Ⅲ類有御衣黃櫻、東錦櫻、紅華櫻、紅手毬櫻、日暮櫻和楊貴妃櫻；第Ⅳ類有Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc 和Ⅳd 4 小類，Ⅳa 含有江戶彼岸櫻、神代曙櫻、紅枝垂櫻、八重紅枝垂櫻、越之彼岸櫻、小彼岸櫻、鵯櫻、思川櫻、白花真櫻、陽春櫻、小松乙女櫻、染井吉野櫻和咲耶姬櫻，Ⅳb 含有才力櫻、河津櫻、兼六園菊櫻、千里香櫻、青肌櫻、修繕寺寒櫻和粉巨人櫻，Ⅳc含有寒櫻、高妙櫻和初美人櫻，Ⅳd含有大寒櫻、大漁櫻、橫濱緋櫻、陽光櫻、寒緋櫻和琉球寒緋櫻。

3 討論

對于確定的植物品種，一般均采用扦插［20～21］、嫁接［22～23］或組培［24～25］等無性繁殖進行擴大再生產，才能保持特定品種的穩定性狀，其遺傳物質完全不會改變（排除基因突變），因此，可以通過比較不同櫻花品種的基因差異用于品種鑒定。本研究中僅有寒緋櫻群里的寒緋櫻、才力櫻、大漁櫻、橫濱緋櫻和陽光櫻等5個品種的ITS序列長度為605 bp，其余83 個品種的ITS 序列長度均為606 bp，此外，trnH-psbA 序列為基因間隔區域，進化選擇壓力較小，其長度變異較大，往往有大量插入/缺失片段，根據結果可知，陽光櫻的trnH-psbA 序列長度為306 bp，內里櫻trnH-psbA 序列長度為289 bp，江戶彼岸群的江戶彼岸櫻、染井吉野櫻、小松乙女櫻、神代曙櫻、澳博拉大葉早櫻、咲耶姬櫻、御帝吉野櫻、陽春櫻和山櫻群的白花真櫻、赤實大島櫻、鵯櫻以及寒緋櫻群的寒緋櫻的trnH-psbA 序列長度為289 bp。因此，可依據DNA 片段長度多態性對部分品種進行分子鑒定。

核基因ITS 包含ITS1、5.8S 和ITS2，其中ITS1和ITS2 為非編碼區，而基因非編碼區所承受的選擇壓力較小，因此，ITS 突變位點（簡約信息位點和單突變位點）多位于ITS1 和ITS2［26］。葉綠體DNA呈單親遺傳（母系遺傳），不存在像核基因那樣的基因重組，編碼基因往往非常保守，但像trnH-psbA等基因間隔序列變異較大，但變異率往往要遠低于核基因［27］。本研究ITS 變異位點百分率（5.3%）遠高于trnH-psbA（2.0%），因此ITS 在櫻屬植物種或種下水平的鑒定率顯著高于trnH-psbA，ITS可作為核心條形碼序列用于系統發育研究，trnH-psbA可作為輔助序列予以應用。此外，插入/缺失現象在葉綠體基因非編碼區較常出現，如陽光櫻有18個堿基（CTTGTAAGTTTATCATTA）的插入，江戶彼岸群的大多數品種都有8 個堿基（TATCATTA）的插入，根據這些特定序列長度也可用于品種的分子鑒定。

本研究88 個品種均引自于日本，而日本的櫻花品種其原始親本均來自9 個野生種［山櫻（Cerasus serrulata）、大山櫻（Cerasus sargentii）、霞櫻（Cerasus verecunda）、江戶彼岸（Cerasus subhirtella）、豆櫻（Cerasus incisa）、大島櫻（Cerasus speciosa）、高嶺櫻（Cerasus nipponica）、深山櫻（Cerasus maximowiczii）和丁字櫻（Cerasus apetala）］以及2 個栽培種［寒緋櫻（Cerasus campanulata）和櫻桃（Cerasus pseudocerasus）］，尤其是日本晚櫻大多是反復雜交所得，其遺傳背景比較復雜，很多日本晚櫻品種親本不詳［7］。日本人Kawasaki 在本田正次和林彌榮［28］分類標準基礎之上，按種系將日本櫻花品種分為7 個群，即山櫻群、江戶彼岸群、寒緋櫻群、豆櫻群、丁字櫻群、櫻桃群、深山櫻群。本研究有54個品種屬于山櫻群，有18個品種屬于江戶彼岸群，有12 個品種屬于寒緋櫻群，有4 個屬于豆櫻群，依據ITS+trnH-psbA構建的系統發育樹的結果，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ主要是山櫻群的櫻花品種，Ⅳ主要是江戶彼岸群和寒緋櫻群的櫻花品種，而豆櫻群的品種不構成單系，與山櫻群混合在一起。因此，利用ITS+trnH-psbA可以較好地將不同品種的櫻花品種合理歸類，作為形態分類的輔助手段。

大島櫻為日本原生種，因其花最大，花量最多，且花朵帶有香味，被廣泛喜愛，培育出的園藝品種也最多（包括變異品種和雜交品種）［1］，我國所說的日本晚櫻其實指的就是具有大島櫻血統的櫻花雜交品種，因此，日本晚櫻中的雜交品種拉丁文本應為Cerasus speciosa，但國內習慣將日本晚櫻花拉丁文描述為Cerasus serrulata，因此本文對日本晚櫻中的雜交品種采用了后一種描述。山櫻群的櫻花品種比較復雜，其絕大多數品種原始親本是大島櫻、山櫻、大山櫻和霞櫻，然后通過彼此間反復雜交形成了今天諸多的山櫻群櫻花品種，從系統發育樹可知，它們彼此間的系統發育關系比較混亂，無規律可循。在第Ⅰ類的Ⅰa 中包含3 個豆櫻（變異）品種，說明ITS+trnH-psbA 組合序列對豆櫻、山櫻（紅山櫻）和大島櫻的分辨率較低，而冬櫻為雜交品種，其系統發育關系與豆櫻變異品種相差較大。江戶彼岸群大部分品種能夠單獨構成一系，但其中有部分雜交品種混入到山櫻群，如十月紅櫻、嘉獎櫻、澳博拉大葉早櫻、雨晴枝垂櫻、十月櫻、御帝吉野櫻和潘多拉櫻，因此，這些雜交品種遺傳物質更多受到山櫻、大山櫻、大島櫻、霞櫻和豆櫻的影響，這7個江戶彼岸群雜交品種分類地位有待進一步確認，此外，江戶彼岸群還混有白花真櫻和鵯櫻，這2 個品種可能具有江戶彼岸櫻的血統。寒緋櫻群的12 個品種全部單獨構成一系，但其中混有青肌櫻、千里香、兼六園菊櫻和高砂櫻，其中青肌櫻為我國原生種（山櫻），與寒緋櫻關系較近，其余兼六園菊櫻和高砂櫻均是花色淡紅的重瓣櫻花，推測均具有寒緋櫻血統，而千里香花色潔白又與青肌櫻較近，且香氣濃郁，推測其是大島櫻或其品種與寒緋櫻品種的雜交品種。本研究中系統不確定的白山2號與大島櫻關系最近，可將其歸類為大島櫻影響的日本晚櫻，其拉丁名可更改為Cerasus serrulata‘Hakusan-nigo’，弘前三段咲櫻拉丁名可更改為Cerasus serrulata‘Hirosaki-sandanzaki’，陽春櫻拉丁名可更改為Cerasus subhirtella‘Yoshun’，粉巨人櫻拉丁名可更改為Cerasus campanulata‘Pin giant’，而潘多拉櫻與山櫻群混在一起，因此建議將其拉丁名更改為Cerasus serrulata‘Pandora’。白雪櫻一般認為是江戶彼岸櫻反復雜交所得，這與本團隊前期利用ISSR 分子標記法所得結果一致，但本研究結果與前期研究結果有所出入，表明利用ITS 和trnH-psbA 兩個條形碼序列不能將白雪正確分類，做出了錯誤的結論，也可能是白雪櫻遺傳背景比較復雜，也表明DNA 條形碼用于物種系統發育有其不足和缺陷。

ITS 和trnH-psbA 可用于種以及以上水平的系統發育研究，可以取得較好結果，但對于種下水平結果往往不理想［29］。本研究結果表明，山櫻群中的各系櫻花品種彼此混亂的聚合在一起，尤其是各類的日本晚櫻，除了山櫻群大部分品種遺傳背景比較復雜以外，還可能是因為山櫻群的各系品種其原始親本系統發育關系本就很近造成的，這也是雜交育種的基礎，因此，我們推測日本的山櫻、大山櫻、大島櫻、霞櫻、豆櫻等原種為近期分化出的物種，系統發育關系較近，并未完全出現生殖隔離。但很多江戶彼岸群和寒緋櫻群的櫻花品種很多也是與山櫻、大山櫻、大島櫻、霞櫻、豆櫻等雜交所得，但能夠與山櫻群品種彼此分離，由此可知，江戶彼岸櫻和寒緋櫻與山櫻、大山櫻、大島櫻、霞櫻、豆櫻系統發育關系相對較遠，但日本櫻屬植物原種彼此間都能夠雜交形成可育后代，嚴格來說都可并為一個種，但形態分類專家依據其形態差異分為了不同種，櫻屬植物是個比較年輕的屬，屬間物種大多可以彼此雜交，根據種的定義，嚴格而言都是亞種。

4 結論

本研究利用ITS和trnH-psbA對88個櫻花品種進行了系統發育關系研究，結果表明，山櫻群櫻花品種系統發育比較混亂，這與其遺傳背景比較復雜以及原始親本系統發育關系較近有關，江戶彼岸群和寒緋櫻群的大多數櫻花品種能夠聚類在一起，與山櫻群品種能分得開，但涉及到很多雜交品種，ITS 和trnH-psbA 難以區分，表明DNA 條形碼技術難以應用到雜交品種的系統發育關系，因此，對于櫻花的雜交品種可采用SSR、ISSR 等分子標記技術，探討彼此間親緣關系。本研究結果可作為櫻花品種分類、嫁接繁殖、系統發育等研究的參考依據。