不同肥料對(duì)無(wú)籽青檸檬種植地土壤肥效、微生物與酶活性的影響

吳彪，柯智，陳喜蓉，鐘劍鋒，林芳能，陽(yáng)記萍

海南省林業(yè)科學(xué)研究院(海南省紅樹(shù)林研究院)，海南?？?71100

檸檬(Citrus limon(L.)Burm.f.)，為雙子葉植物綱蕓香科柑橘屬植物，又稱(chēng)洋檸檬、檸果、益母果等。臺(tái)灣無(wú)籽青檸檬是青檸檬和四季檸檬的雜交品種[1]，可用枝條扦插繁殖，因其既耐熱又抗寒的特性，一年四季均可開(kāi)花結(jié)果。其果無(wú)核多汁，富含維生素，果實(shí)成熟后果皮黃綠色或淡黃色[2]。

有研究表明菌肥可以改善土壤環(huán)境，影響土壤微生物數(shù)量和土壤酶活力，培肥地力，提高肥料利用率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)抗性，減少病蟲(chóng)害發(fā)生[3-4]。

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解、碳氮循環(huán)以及成土過(guò)程，影響植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收釋放。土壤微生物會(huì)間接影響土壤肥力與植物營(yíng)養(yǎng)。微生物分泌的土壤酶在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，另外土壤酶還來(lái)源于植物根系及其殘?bào)w、土壤動(dòng)物及其遺骸，能催化土壤中復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)化合物，供植物再利用[5]。土壤酶活性作為反映土壤中各種生物化學(xué)過(guò)程的方向和強(qiáng)度的指標(biāo)[6]，參與了有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)等重要機(jī)制。其中土壤過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶活性對(duì)評(píng)價(jià)土壤肥力水平起著重要作用[7]。

該研究以在無(wú)籽青檸檬種植地施不同肥料為研究對(duì)象，利用微生物純培養(yǎng)技術(shù)和Biolog-ECO 技術(shù)分析施肥后土壤可培養(yǎng)微生物及其群落功能多樣性以及土壤酶活性[8-9]，以期為無(wú)籽青檸檬的施肥管理提供理論基礎(chǔ)，推動(dòng)無(wú)籽青檸檬高產(chǎn)、綠色環(huán)保的種植方式的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試材料

臺(tái)灣無(wú)籽青檸檬種苗為市售，種苗主桿統(tǒng)一定桿株高為25cm，地徑0.8cm～1.2cm。

菌肥是以廢棄菌糠和雞糞為基質(zhì)，按1：1 充分混勻，添加1%的腐熟菌劑初發(fā)酵21d 后，添加0.5%的功能菌劑進(jìn)行發(fā)酵制成。菌糠主要填充物為橡膠木屑和麩皮。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2017 年～2018 年分別在定安龍州、瓊山三門(mén)坡和儋州木棠基地進(jìn)行，檸檬園為緩坡地。3個(gè)樣地基本概況如表1 所示。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無(wú)籽青檸檬種植地施肥量設(shè)置

每個(gè)試驗(yàn)地劃分為2 個(gè)相等的小區(qū)，每個(gè)小區(qū)30m2～50m2，分別進(jìn)行施肥組和未施肥組的對(duì)比試驗(yàn)，菌肥與普通肥的對(duì)比，定安龍州基地與瓊山三門(mén)坡基地、儋州木棠新北岸基地對(duì)比，每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)。菌肥組按不同施肥量2kg/m2、4kg/m2、6kg/m2，普通肥按田間常規(guī)施肥量2kg/m2，分別在2018 年4月、6 月、8 月重復(fù)3 次施肥，另外設(shè)計(jì)不施肥作為對(duì)照處理。

1.3.2 土壤樣品的采集

每個(gè)小區(qū)采用“S”形取樣法采取5 點(diǎn)土樣，土樣深度5cm～10cm。裝入貼好對(duì)應(yīng)標(biāo)簽的無(wú)菌袋，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于4℃冰箱待用，于當(dāng)天分析土樣[1]。

1.3.3 土壤可培養(yǎng)微生物的測(cè)定

參考林先貴分離純化培養(yǎng)土壤微生物的方法，采用常規(guī)涂布平板分離計(jì)數(shù)法測(cè)定土壤中可培養(yǎng)微生物[8]。

1.3.4 Biolog- ECO 測(cè)定

（1）Biolog-ECO 樣品的處理及測(cè)定

參考章家恩等方法[9]，稱(chēng)取5g 鮮土加入裝有100mL 的0.85%NaCl 滅菌生理鹽水的三角瓶中，120r/min 振蕩培養(yǎng)30min，冰浴中靜置2min；取5mL上清液加入到裝有45mL 無(wú)菌水的三角瓶中搖勻稀釋?zhuān)貜?fù)稀釋2 次，制得1：100 的懸濁液用于ELSIA反應(yīng)；吸取150μL 懸濁液滴入已預(yù)熱的Biolog ECO 平板孔中，28℃恒溫避光培養(yǎng)9d；每隔24h 用Biolog 讀數(shù)器讀取590nm 和750nm 的吸光值[10]。（2）土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

平均吸光值(AWCD)是反映微生物群落活性的有效指標(biāo)，其變化率和最終值可以反映土壤微生物群落利用碳源進(jìn)行代謝的總能力[11]。計(jì)算公式為：AWCD=∑(Ci-R)/n，式中Ci為每個(gè)孔的吸光值，R 為對(duì)照孔的吸光值，n 為培養(yǎng)基碳源總數(shù)，此實(shí)驗(yàn)中n為31。

Shannon 指數(shù)(H’)可以表征群落中物種的豐富度，計(jì)算公式：H’=-∑Pi·ln(Pi)，Simpson 指數(shù)（D）表征最常見(jiàn)種的優(yōu)勢(shì)度，表現(xiàn)微生物對(duì)碳源利用多樣性方面，更側(cè)重對(duì)差異性的描述[13]，計(jì)算公式為：D=1-∑(Pi)2。上述兩個(gè)式中：Pi為第i 個(gè)有培養(yǎng)基的孔和對(duì)照孔的光度值差與所有板總差的比值[12]。

McIntosh 指數(shù)（U）公式如下，式中：ni為第i 孔的相對(duì)吸光值[10]。

Pielou 指數(shù)（E）是通過(guò)Shananon-Wiener 指數(shù)計(jì)算出來(lái)的精度，指的是微生物群落實(shí)測(cè)多樣性和最大多樣性的比率，表征土壤微生物群落的均一性。計(jì)算公式如下：E=H’/lnS 式中：S 為被利用碳源總數(shù)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤肥效

從表2 中可以看出，定安龍州、瓊山三門(mén)坡和儋州木棠基地種植的無(wú)籽青檸檬各施肥組的土壤pH、堿解氮、速效鉀和速效磷含量均大于對(duì)照組，其中4kg/m2菌肥組土壤中的堿解氮、速效鉀和速效磷含量最大， 定安龍州分別達(dá) 134.18mg/kg、146.57mg/kg、200.84mg/kg；瓊山三門(mén)坡分別達(dá)160.43mg/kg、175.28mg/kg、205.67mg/kg；儋州木棠124.67mg/kg、140.68mg/kg、191.05mg/kg。另外，菌肥組土壤中的堿解氮、速效鉀和速效磷含量整體隨著菌肥量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。定安龍州、瓊山三門(mén)坡和儋州木棠4kg/m2菌肥組土壤的堿解氮、速效鉀和速效磷比對(duì)照組分別提高32.6%、30.2%、14.8%；33.3%、16%、10.2%；33.4%、29.5%和22.2%。這一結(jié)果也充分說(shuō)明施用菌肥有效提高了無(wú)籽青檸種植土壤的肥效，有利于無(wú)籽青檸檬的生長(zhǎng)，同樣有利于提高無(wú)籽青檸檬果的品質(zhì)。

表2 不同施肥模式下土壤肥效Tab.2 Effects of different fertilization patterns on soil fertility

2.2 土壤可培養(yǎng)微生物

2.2.1 土壤微生物種類(lèi)與總數(shù)

從表3 中可以看出，不同施肥模式下定安龍州基地種植的無(wú)籽青檸檬土壤中可培養(yǎng)微生物總數(shù)為4kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞6kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組，4kg/m2菌肥組土壤中可培養(yǎng)的細(xì)菌總數(shù)、放線(xiàn)菌總數(shù)和真菌總數(shù)均大于其他施肥組。該基地種植的無(wú)籽青檸檬施用菌肥后土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)、放線(xiàn)菌總數(shù)和真菌總數(shù)均隨著施肥量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)；不同施肥模式下瓊山三門(mén)坡基地種植的無(wú)籽青檸檬土壤中可培養(yǎng)微生物總數(shù)為6kg/m2菌肥組＞4kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞2kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組，6kg/m2菌肥組土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)、放線(xiàn)菌總數(shù)大于其他施肥組，而4kg/m2菌肥組土壤中的真菌總數(shù)大于其他施肥組。該基地種植的無(wú)籽青檸檬施用菌肥后土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)隨施肥量的增加而增加，真菌隨施肥量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，放線(xiàn)菌總數(shù)與施肥量的多少呈現(xiàn)不規(guī)則的變化；不同施肥模式下儋州木棠基地種植的無(wú)籽青檸檬土壤中可培養(yǎng)微生物總數(shù)為4kg/m2菌肥組＞6kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞空白對(duì)照組＞2kg/m2菌肥組，4kg/m2菌肥組土壤中可培養(yǎng)的細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)均大于其他施肥組。該基地種植的無(wú)籽青檸檬施用菌肥后土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)隨著施肥量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，放線(xiàn)菌總數(shù)與施肥量的多少呈現(xiàn)不規(guī)則的變化。

表3 不同施肥模式下土壤中可培養(yǎng)微生物Tab.3 Culturable microorganisms in soil under different fertilization patterns

由表3 可見(jiàn)，就施肥量來(lái)看，定安龍州基地、瓊山三門(mén)坡基地和儋州木棠基地?zé)o籽青檸檬地分別施用4kg/m2、6kg/m2、4kg/m2菌肥的土壤中的細(xì)菌和真菌總數(shù)最多，最有利于土壤有機(jī)和無(wú)機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化，能更好的參與土壤有機(jī)質(zhì)分解與腐殖酸合成，直接影響土壤肥力，同時(shí)有利于氨化作用。另外，定安龍州基地、瓊山三門(mén)坡基地和儋州木棠基地?zé)o籽青檸檬地分別施用4kg/m2、6kg/m2、6kg/m2菌肥的土壤中的放線(xiàn)菌最多，有利于提高土壤形成抗生物質(zhì)的能力，對(duì)無(wú)籽青檸檬的病蟲(chóng)害防治具有重要的意義。

2.2.2 土壤微生物平均吸光值（AWCD）變化特征

從圖1 看出，每隔24h，連續(xù)9d 測(cè)得的吸光值平均變化率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，不同施肥組土壤微生物均在開(kāi)始的24h 沒(méi)有明顯變化，即24h以?xún)?nèi)土壤微生物活性較低；而在48h～168h 內(nèi)快速升高，隨后持續(xù)緩慢地升高至試驗(yàn)結(jié)束。平均吸光值(AWCD) 總體變化趨勢(shì)6kg/m2菌肥組＞4kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞空白對(duì)照組。

圖1 不同施肥模式下土壤微生物平均吸光值Fig.1 Average absorbance of Soil Microorganism under different fertilization modes

2.2.3 土壤微生物利用不同碳源的變化特征

從圖2 可以看出，隨著時(shí)間的推移，不同施肥組土壤微生物對(duì)6 類(lèi)碳源的利用越來(lái)越高。從整體趨勢(shì)來(lái)看，不同施肥組的土壤微生物對(duì)碳水化合物碳源、氨基酸類(lèi)碳源、多聚物、羧酸碳源利用均為4kg/m2菌肥組＞6kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞對(duì)照組。對(duì)酚酸類(lèi)碳源的利用為6kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組＞4kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組；對(duì)胺類(lèi)碳源的利用利用為6kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞4kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞空白對(duì)照組。不同施肥組土壤微生物對(duì)6 大類(lèi)碳源利用情況的的不同，說(shuō)明不同施肥組土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)、種類(lèi)和數(shù)量均存在差異，導(dǎo)致不同樣地的土壤微生物多樣性不同。

圖2 不同施肥模式下土壤微生物利用碳源情況Fig.2 Carbon source utilization by soil microorganisms under different fertilization patterns

2.2.4 土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

從圖3 可以看出，不同處理土壤微生物在培養(yǎng)168h 的McIntosh 指數(shù)(U 值)總體趨勢(shì)均為4kg/m2菌肥組＞6kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組＞2kg/m2普肥組，各施肥組的U 值差異顯著，其中4kg/m2施肥組和6kg/m2施肥組與其他施肥差異極顯著。不同施肥組土壤微生物在培養(yǎng)168h 的H’值、D 值和E 值差異不顯著。

圖3 不同施肥模式下土壤微生物多樣性指數(shù)Fig.3 Soil microbial diversity index under different fertilization patterns

2.3 土壤酶活性

從表4 中可以看出，定安龍州施用6kg/m2菌肥組土壤中的蔗糖酶、多酚氧化酶和過(guò)氧化氫酶含量均大于其他施肥組，施用2kg/m2菌肥組土壤中的脲酶均大于其他施肥組。從不同施肥方式下的土壤中蔗糖酶含量指標(biāo)來(lái)看，6kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞2kg/m2菌肥組＞4kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組；脲酶含量指標(biāo)2kg/m2菌肥組＞6kg/m2菌肥＞空白對(duì)照組＞4kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組；多酚氧化酶含量指標(biāo)6kg/m2菌肥組＞2kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞4kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組；過(guò)氧化氫酶含量指標(biāo)6kg/m2菌肥組＞2kg/m2普肥組＞2kg/m2菌肥組＞空白對(duì)照組＞4kg/m2菌肥組。由此可見(jiàn)，土壤中與土壤肥力關(guān)系密切的過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、蔗糖酶與施肥量間的規(guī)律不明顯。

由于瓊山三門(mén)坡基地和儋州木棠基地施肥晚于定安龍州基地，土壤酶活性指標(biāo)分析時(shí)，僅采集了施用4kg/m2菌肥組的土壤進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明瓊山三門(mén)坡施用4kg/m2菌肥土壤中的酶含量脲酶＞蔗糖酶＞過(guò)氧化氫酶＞多酚氧化酶，儋州木棠基地施用4kg/m2菌肥土壤中的酶含量脲酶＞多酚氧化酶＞過(guò)氧化氫酶＞蔗糖酶。無(wú)籽青檸檬盆栽樣品的處理盆栽土施用4kg/m2菌肥土壤中的酶含量脲酶＞蔗糖酶＞多酚氧化酶＞過(guò)氧化氫酶。

表4 不同施肥模式下土壤酶活性Tab.4 Soil enzyme activities under different fertilization patterns

3 結(jié)論與討論

3.1 施用菌肥對(duì)土壤可培養(yǎng)微生物和肥效的影響

從目前定安龍州、瓊山三門(mén)坡和儋州木棠基地試種無(wú)籽青檸檬不同施肥方式下的土壤中可培養(yǎng)微生物（細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌）的分析結(jié)果來(lái)看，無(wú)籽青檸檬施用4kg/m2～6kg/m2菌肥有利于土壤中微生物的生長(zhǎng)和代謝，有利于改善土壤結(jié)構(gòu)，能更好的參與土壤有機(jī)質(zhì)分解與腐殖酸合成，促進(jìn)土壤腐殖質(zhì)的生成，直接影響土壤肥效，增加植物抗性、促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收、減少病原危害，對(duì)無(wú)籽青檸檬的生長(zhǎng)和病蟲(chóng)害的防治，以及無(wú)籽青檸檬果的品質(zhì)具有重要的作用。

3.2 施用菌肥對(duì)土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

從目前定安龍州、瓊山三門(mén)坡和儋州木棠基地試種無(wú)籽青檸檬不同施肥方式下的土壤中多樣性指數(shù)的分析結(jié)果來(lái)看，4kg/m2施肥組的McIntosh 指數(shù)(U 值) 顯著高于其他施肥組，各施肥組的Shananon-Wiener 指數(shù)(H’值)、Simpson 指數(shù)(D 值)和Pielou 均勻度指數(shù)(E 值)差異不顯著。說(shuō)明施用菌肥可以調(diào)節(jié)土壤微生物多樣性的指數(shù)，但對(duì)各指數(shù)的調(diào)節(jié)效應(yīng)不同。從研究的土壤中微生物多樣性指數(shù)來(lái)看，無(wú)籽青檸檬施用4kg/m2菌肥對(duì)土壤中微生物的McIntosh 指數(shù)(U 值)調(diào)節(jié)最佳，有利于無(wú)籽青檸檬的生長(zhǎng)。

3.3 施用菌肥對(duì)土壤酶活性的影響

從目前定安龍州、瓊山三門(mén)坡和儋州木棠基地試種無(wú)籽青檸檬不同施肥方式下的土壤中酶活性（蔗糖酶、脲酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶）的分析結(jié)果來(lái)看，施用6kg/m2菌肥試驗(yàn)組的土壤中的4 種酶活性整體優(yōu)于其他試驗(yàn)組。這說(shuō)明無(wú)籽青檸檬施用6kg/m2菌肥有利于提高土壤中幾種關(guān)鍵酶的活性，對(duì)無(wú)籽青檸檬的生長(zhǎng)具有重要的作用。