環狀RNA在肝細胞癌中的研究進展

陸瀅雪 綜述 羅新華 審校

(1.貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫院，貴州 貴陽 550002)

高通量測序技術的發展使大量非編碼RNA被發現。ncRNA參與許多疾病的病理過程。近20年來，人們鑒定出許多種類ncRNA，如長鏈非編碼RNA (lncRNA)、miRNA(micro RNA)和circRNA[1]。circRNA于1976年被發現，曾被認為是前體mRNA (pre-mRNA)錯接的副產品，至今已發現了上萬種。circRNA主要由外顯子或內含子序列產生，反向互補序列或RNA結合蛋白(RBPs)是環狀RNA生物發生的必要條件。最近的報道[2]顯示，circRNA可以作為microRNA (miRNA)海綿來保護mRNA的翻譯，通過剪接和轉錄過程來影響親代基因的表達，或者與蛋白質相互作用來影響其功能。有證據[3]表明，circRNA參與了HCC的發生，并在許多生物學過程中發揮了關鍵作用。circRNA可作為一種潛在的診斷生物標志物和治療靶點，而circRNA在HCC中的潛在機制目前尚不清楚。

1 circRNA 的形成

circRNA 主要有3種類型：外顯子來源的circRNA(ecircRNA)、內含子來源的circRNA(ciRNA)、外顯子—內含子circRNA。目前發現的circRNA，80%為ecircRNA。ecircRNA的形成機制主要有兩種途徑：套索驅動環化和內含子配對驅動環化。ciRNA主要通過自我剪接內含子形成。EIciRNA的形成機制目前尚未研究清楚。

2 circRNA的分子特征

(1)circRNA廣泛存在于真核生物體的不同組織，如睪丸、大腦、胃、乳腺和前列腺等，多數位于細胞質，少數位于細胞核，非常穩定，不易被核酸外切酶RNaseR降解。(2)circRNA序列高度保守，具有細胞、組織類型特異性和階段特異性。(3)大多數circRNA由蛋白質編碼基因的外顯子組成，少數由內含子或內含子片段直接環化形成。(4)作為miRNA海綿競爭性結合miRNA的結合位點，使miRNA失去其自身功能及對下游靶基因的調節功能。(5)多數circRNA在轉錄后發揮調控作用，少數只能在轉錄水平發揮調控作用。(6)與蛋白質相互作用，miRNA效應器可以與circRNA結合而被降解。同時，circRNA通過與蛋白質相互作用參與調節細胞的多種生理過程。(7)參與蛋白質翻譯，大多數circRNA為ecircRNA，主要存在于細胞質中，因此，可以裝載至核糖體中，并翻譯成多肽。

3 circRNA的功能

一些具有相同miRNA應答元件的RNA可以競爭性結合miRNA位點來影響miRNA對其靶基因的作用，從而影響腫瘤的生物學行為，稱為miRNA的“海綿作用”(miRNA sponge)。circRNA也能夠競爭性結合miRNA位點，影響miRNA及下游靶基因的表達。circRNA通過應答元件與miRNA相互關聯后，既可以作為腫瘤抑制因子，又可以作為一種原癌基因在腫瘤的發生、發展過程中發揮作用。競爭性內源性RNA(ceRNAs)包含mRNA、假基因轉錄物、lncRNAs和circRNA ，可以競爭結合miRNA。因此，ceRNAs的存在或缺失會影響miRNAs對基因表達的調控。如果ceRNA基因表達出現失調，就可能發生疾病。

4 HCC中的circRNA

HCC惡性程度高，復發率高，對多種化療藥物耐藥，預后差。HCC通常通過血液或淋巴轉移，只要發生轉移就很難控制[4]。然而，HCC缺乏有效的臨床預測、診斷和治療方法，促使科學家尋找更好的腫瘤標志物。最近，研究人員發現ncRNA尤其是環狀RNA的失衡表達在HCC中更為常見，與疾病的發展密切相關。這一現象表明，科學家可能能夠在circRNA領域闡明HCC的發病機制，找到HCC的治療靶點。

5 作為HCC的抑制劑或促進劑

circRNA具有大量的miRNA結合位點，這些位點有助于circRNA與miRNA相互作用[5]。研究[6]證明circRNA可以通過與miRNA相互作用調控親本基因的表達。has_circ_0005075可能與四種miRNA相互作用，包括hsa-miR-23b-5p、hsa-miR-93-3p、hsa-miR-581和hsa-miR-23 a-5p，從而抑制這些miRNA的表達和功能，提示HCC中has_circ_0005075的高表達水平與腫瘤進展相關，has_circ_0005075可能作為一種新的HCC生物標志物[7]。

從circRNA芯片分析中篩選出的circ_100338的上調與肝癌合并HBV感染患者的累積低生存率密切相關,且與肝癌的轉移進展呈正相關。circ_100338作為miR-141-3p的海綿,可被miR-141-3p拮抗,抑制肝癌細胞轉移進展。miR-141-3p過表達對侵襲能力的抑制可通過miR-141-3p和circ-100338在MHCC97H細胞中共表達來恢復。同樣，circ_100338誘導的MHCC97H細胞遷移和侵襲能力的增強也可以通過miR-141-3p上調來挽救。這些結果表明，circ_100338作為一種新的生物標志物，在HBV相關的HCC患者的診斷和患者生存評估中具有潛在價值。

多種信號通路已被報道參與HCC的病理機制。FZD5據報道為受體和Wnt/β-catenin信號通路的催化劑。hsa_circ_0067934可以通過Wnt/β-catenin信號通路吸附mir-1324海綿，使其在HCC中表達上調。miR-1324可以靶向FZD5的3′-UTR 損害 Wnt/β-catenin信號通路的激活。敲低circ-0067934或miR-1324過表達既能下調FZD5表達和抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活,顯著抑制肝癌細胞系Hep3B和HuH7細胞增殖、遷移和入侵。結果表明,circ_0067934/miR-1324/FZD5/Wnt/β-catenin信號軸可能作為一種很有前途的HCC干預的目標。進一步研究發現miR-129-5p靶點hsa_circ_0005986明顯低于正常組織[8]。hsa_circ_0005986低表達水平與慢性乙型肝炎家族史、腫瘤直徑、微血管浸潤和BCLC階段有關，而實驗顯示hsa_circ_0005986釋放miR-129-5p下調和減少Notch1-mRNA的表達水平相關。有趣的是，hsa_circ_0005986的下調通過促進G0/G1向S期轉變，從而促進細胞增殖。前期實驗提示，這種轉變受到G0/G1調節基因2(G0S2)的調控，G0S2可能是通過激活HCC細胞增殖的重要調控因子PPARα，是脂肪酸在肝臟分解代謝的關鍵調節器[9]，因此hsa_circ_0005986通過調節細胞增殖，參與肝癌HCC進展。

有研究[10-11]分析了人類環狀RNA在HCC組織中的表達譜，發現在HCC組織中顯著下調的circRNA:circMTO1(hsa_circRNA_0007874/hsa_circRNA_104135),可以作為致癌miR-9的海綿，與HCC患者預后不良密切相關。在細胞質中，circMTO1結合miR-9可以上調p21的表達，抑制HCC的進展。p21已被確定為miR-9的腫瘤抑制因子[12]。敲低circMTO1可促進細胞增殖和侵襲，減少細胞凋亡，降低p21 mRNA和蛋白表達，而過表達circMTO1可促進細胞凋亡，上調p21的mRNA和蛋白表達。此外，miR-9過表達對腫瘤細胞的影響與circMTO1沉默類似。通過對miR-9在cric MTO1沉默細胞中的抑制實驗發現，miR-9抑制劑可以抑制circMTO1敲低在HCC細胞中的促進作用，證明circ MTO1可以通過circ MTO1/miR-9/p21軸，海綿化miR-9，抑制miR-9致癌作用。此外，circ MTO1的下調抑制了p21和下游CDK2的表達，而侵襲和增殖標志物MMP2和PCNA在體內上調，說明circ MTO1在體內和體外均能抑制HCC的進展[13]。因此，circ MTO1有可能成為肝癌的預后預測指標和治療靶點。另一項研究[13]分析顯示，從SMYD4轉錄而來的hsa_circ_0004018的下調的環狀RNA與血清AFP水平、腫瘤直徑、分化程度、BCLC分期和TNM分期相關。結果表明，hsa-circ-0004018具有一個HCC階段的特異表達。SMYD4被報道為一種潛在的腫瘤抑制因子，參與了腫瘤發生[14]，提示hsa_circ_0004018作為SMYD4的轉錄本可能參與HCC的發生發展。此外，hsa_circ_0004018的敏感性優于AFP，這意味著hsa_circ_0004018可能在HCC監測中發揮重要作用。進一步的生物信息學預測表明，hsa_circ_0004018含有5個miRNA序列，可能通過與miR-30e-5p/miR-626-MYC相互作用而在肝癌的發生和轉移中發揮重要作用。

由于DExH-Box解旋酶9(DHX9)的調節，HCC組織中cSMARCA5(hsa_circ_0001445)表達下調，而SMARCA5 mRNA和蛋白表達上調[15]。沉默DHX9可以上調cSMARCA5的表達，說明circRNA的調控依賴于DHX9的解旋酶活性。進一步的實驗表明，cSMARCA5可能通過DHX9-cSMARCA5-miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3途徑抑制肝癌的生長和轉移，發揮抑癌作用;而其親本基因SMARCA5可能是腫瘤啟動子[15]，提示SMARCA5和cSMARCA5水平可能共同作為HCC的生物標志物。

肝脂肪變性參與了HCC疾病的進展。circRNA-0046367是從ncRNA數據庫中篩選出來的circRNA，作為miR-34a的內源性調節劑，在誘導的脂肪變性HCC細胞中顯著降低。對這些下調的circRNA-0046367失去抑制miR-34/PPARα交互,導致脂質過氧化損傷,從而降低肝脂肪變性。配體依賴性轉錄因子和PPARα是一個基礎脂肪酸代謝。PPARα的下調將減少PPARα介導脂類代謝,導致肝細胞脂肪變性，表明circRNA0046367/miR-34a PPARα軸可能參與脂肪氧化和減少肝脂肪變性誘導HCC。此外，在circRNA-0046366中也觀察到同樣的結果。

通過分析circRNA測序數據集，篩選出circ C3P1作為HCC中下調最明顯的環狀RNA之一。通過對臨床資料的分析，circ C3P1的表達與TNM分期、腫瘤大小、血管浸潤程度呈負相關，分析也表明，circ C3P1表達越高，肝癌患者的生存率越低。進一步研究發現，circ C3P1在體內和體外過表達均能顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，說明circ C3P1可作為肝癌的抑癌因子。此外，circ C3P1可以促進糖異生的關鍵酶PCK1在HCC中下調，而在HCC中通過海綿作用miR-4641降低PCK1可能導致肝癌的發生。通過沉默PCK1，可以消除circC3P1過表達對HCC細胞的抑制。這些結果表明，circ C3P1/miR-4641/PCK1軸可以調節肝癌的生長和轉移，并作為肝癌患者預后的生物標志物。

has_circ_0001649在HCC組織中發現明顯下調。沉默has_circ_0001649可導致MMP9、MMP10、MMP13的降低，從而增加HCC的轉移，說明has_circ_0001649的下調與HCC的轉移和生長呈正相關。進一步分析表明，has_circ_0001649與HCC預后不良有關，可能作為HCC的生物標志物。序列分析顯示，has_circ_0001649可能存在海綿吸附或轉錄調節劑的潛力，含有一個U2輔助因子(U2AF)結合位點、五個真核起始因子4A-III (EIF4A3)結合位點和一個轉錄本(UPF1)結合位點參與HCC的發生發展。此外，通過生物信息學分析，has_circ_0001649也被認為是miRNA海綿。

circ-ITCH通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制癌癥擴散，circ-ITCH在HCC組織中的表達低于癌旁組織，circ-ITCH的高表達與HCC良好的生存率相關[16]。進一步分析表明，circ-ITCH中rs10485505和rs4911154兩個單核苷酸多態性位點(SNPs)與HCC風險增加密切相關。這些結果表明circ-ITCH可能具有抑制HCC的作用[16]。

ZKSCAN1是一種鋅家族基因，在多種癌癥中上調并與腫瘤細胞增殖有關。ZKSCAN1的第2外顯子和第3外顯子拼接在一起形成了circZKSCAN1的環狀RNA (hsa_circ_0001727)，在人肝臟中含量豐富。HCC中ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1均明顯下調。ZKSCAN1 mRNA的下調與腫瘤大小有關，而circ ZKSCAN1水平影響腫瘤數量、肝硬化、微血管浸潤及腫瘤分級。進一步的實驗表明，沉默或過表達RNA分別在體內和體外增強或抑制細胞增殖、遷移和侵襲。上述實驗中未觀察到相互干擾，這意味著這兩種同源的RNA在HCC中可能具有不同的調控特征。RNA-seq支持ZKSCAN1 mRNA調控細胞代謝和circ ZKSCAN1參與腫瘤相關信號通路的假說[17]。因此，ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1可能通過相互作用抑制HCC的代謝、凋亡、增殖和轉移，從而發揮HCC抑制劑的作用。

有趣的是,許多作為miRNA海綿的環狀RNA也可以被認為是HCC的抑癌因子，如cSMARCA5、circ MTO1、circ C3P1，而有些環狀RNA可以作為腫瘤啟動子，如has_circ_0005075、circ_100338[24(90)]等。這說明環狀RNA在HCC中的作用機制是復雜的。circRNA可以作為腫瘤抑制因子或啟動子，與或不與海綿miRNA結合，參與蛋白質的結合，這表明，一個circRNA可能通過不同的途徑影響不同的HCC進展，這意味著circRNA有可能成為HCC的生物標志物或治療靶點。

6 小結與展望

隨著研究的推進，circRNA的功能不斷被揭示，從錯誤剪接的副產品到具有重要生物學功能的小分子。與其他ncRNA一樣，許多環狀RNA被證實參與了HCC的進展。在這篇綜述中，我們證明circRNA是一種豐富、穩定、保守、結構多樣的ncRNA，在疾病尤其是HCC的調控、預測、診斷和治療靶點方面具有巨大的潛力。然而，由于circRNA復雜的作用機制，目前我們還不能很清楚的解釋circRNA是如何參與HCC的發展的。重要的是，circRNA在細胞中的作用和作用方式也有待發現。此外，circRNA結構的特殊性和技術的不足限制了對circRNA功能的研究[18]。目前，HCC中大多數已鑒定的環狀RNA功能為miRNA海綿和/或癌抑制因子或啟動子。有研究報道circRNA可以通過直接與關鍵蛋白結合來調控癌癥的發展。且有轉化成蛋白質或多肽參與癌癥進展的潛力。ciRNA和EIciRNA可以與聚合酶II和U1snRNP相互作用，調節其親本基因的轉錄。因此，circRNA是否在轉錄水平或轉錄后水平參與HCC的過程，或是否通過直接翻譯成蛋白發揮作用仍是一個謎。如果是，circRNA是如何參與這些過程的?如果沒有，circRNA是否有其他途徑影響HCC?

一項新的研究[19]表明，除了細胞外，外泌體、血液和唾液中也發現了豐富的環狀RNA。此外，血清外泌體—環狀RNA可能能夠區分癌癥患者和健康個體，這表明環狀RNA可能作為癌癥診斷的循環生物標志物。由于外泌體由所有細胞分泌并在血液中循環，circRNA可能會影響外泌體運輸遠端細胞的方式。一項研究發現，肝癌細胞分泌的外泌體miRNA miR-103可影響肝癌轉移，增強血管完整性[20]。作為ncRNA的一員，穩定的環狀RNA通過分泌進入血液循環的方式影響肝癌的進展，在潛在的癌癥檢測中發揮著至關重要的作用，或者直接與癌相關基因相互作用，調控肝癌的關鍵基因，但目前機制尚不清楚。

因此，環狀RNA可能參與疾病發展、組織發育和基因調控，其中一些環狀RNA在致癌過程中發揮重要作用[21]。然而，通過少量的整合研究，我們只能得出circRNA參與HCC發展的結論，而不能得出circRNA在HCC發展過程中必須發揮關鍵作用的結論。可以肯定的是，隨著技術的不斷發展和研究的不斷推進，如RNA測序對ncRNA]等實驗技術的不斷發展，circRNA在HCC發展中的作用將逐漸顯現。因此，開發和使用合適的技術來闡明環狀RNA在HCC中的分子機制及其調控機制將是未來研究的重點。