銅綠假單胞菌性角膜炎發病機制的研究進展

王 嵐，李 妍，孫子雯，胡竹林

0 引言

角膜作為眼球最先接觸外界的部分，容易受外傷，易與細菌、真菌、病毒等各類微生物接觸，從而引發感染性角膜炎[1]。銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)是角膜細菌感染最常見的病原菌之一[2]。PA誘發的角膜炎發展迅速，并且極具破壞性[3]，通常在24～48h內迅速發展為急性化膿性潰瘍,角膜中央會形成白色浸潤，分泌膿性分泌物，角膜基質凝固性壞死[4]。若治療不及時，隨著病情的快速發展，角膜可溶解穿孔，甚至造成不可逆結局，最終需摘除眼球[5]。即使積極治療，在潰瘍治愈后也可能會留有后遺癥，患者甚至最終會出現永久性視力障礙[6]。銅綠假單胞菌性角膜炎(以下簡稱PA角膜炎)不但發病率高，而且臨床治療棘手，主要原因是針對PA角膜炎的發病機制沒有明確的研究結果[7]。近年來國內外對于PA引起角膜炎癥的發病機制已有較多研究與報道，目的是針對發病各環節的特異性治療靶點，為尋找有效的治療提供理論依據[8-9]。現階段研究發現，造成PA角膜炎的主要發病機制與PA的侵襲力、毒力因子以及角膜的免疫應答有關。本文就有關的發病機制的研究進展進行總結。

1 PA侵襲力

PA能入侵并定植于角膜，大量繁殖、進行侵襲，短時間內形成潰瘍灶并逃避宿主免疫，這有賴于PA的侵襲力。PA的侵襲力包括粘附性、群體感應及生物膜形成。

1.1 粘附性PA不能附著于完整的角膜上皮，只有在缺損的角膜表面粘附才有機會進行繁殖擴散、聚積毒力直至侵入組織并導致感染。PA表面可產生多種粘附因子，其中鞭毛、菌毛和凝集素與角膜上皮細胞表面受體相互作用，參與細菌在人角膜的定植和感染。PA鞭毛可與受損角膜上皮的唾液酸鞘糖脂GM1(sialo-GM1)結合，介導細菌脂多糖(lipopolysaeeharide，LPS)的粘附作用[10]，并且缺失鞭毛后PA不能粘附于角膜。Ⅳ型菌毛產生的菌毛蛋白可粘附于細胞表面的黏蛋白，參與感染過程中的定植[9]。凝集素可識別宿主細胞的細菌胞外糖蛋白，介導PA粘附，加重角膜損傷[11]。抗鞭毛抗體對PA定植有潛在的預防作用，針對Ⅳ型菌毛的小分子抑制劑可阻礙菌毛的組裝與分離，降低PA粘附性[12]，目前已有報道可證明凝集素抑制劑能阻斷凝集素與受損角膜表面的細胞結合，減少PA對上皮細胞的粘附[13]。

1.2 群體感應系統群體感應系統(quorum sensing system,QS)是PA與宿主細胞之間進行信號傳導的通訊系統。PA粘附于受損角膜后，可分泌大量信號分子，QS感知信號分子濃度來感應群體的密度，并調控與毒力產生、生物膜形成、生長定植等相關的基因[14]，來增強PA對角膜微環境的適應性，最終形成利于PA侵襲、定植于角膜的優勢表型[14-15]，造成角膜的急性感染。

目前研究報道的PA有4個群體感應子系統：Las、Rhl、Pqs、Iqs。PA角膜炎主要受Las和Rhl系統調控[16]。這兩個系統的共同點是以AHL(N-acylhomoserine lactose)作為信號分子。Las系統編碼LasI和LasR，LasI促3OC12-HSL(N-3-oxo-dodecanoyl-homoserine lactone)信號分子產生。當PA群體濃度達到閾濃度時，3OC12-HSL分子與LasR結合，啟動QS調控基因的表達。LasR調節如彈性蛋白酶(LasB)、外毒素A(ToxA)、氰化氫(hcnABC)等多種毒力因子的表達[17]。這些毒力因子不僅能夠增強細菌自身侵襲力，破壞角膜上皮細胞的屏障功能，還可以刺激宿主產生免疫應答，誘導急性炎癥導致嚴重的角膜損害。Rhl系統由RhlI和RhlR組成。RhlI參與促C4-HSL(N-butanoyl-homoserine lacton)產生，并調控次級代謝產物如鼠李糖脂、綠膿菌素的釋放[2,14]，協同毒力因子，對宿主免疫系統進行攻擊，降低宿主對細菌的吞噬，抵抗宿主防御機制。在Zhu等[18]進行的臨床報道中指出他們納入研究的所有細菌性角膜炎患者，角膜潰瘍組織培養物中均含LasI，LasR，RhlI和RhlR，表明QS在角膜炎致病機制中起重要作用。

Las和Rhl系統的群體感應抑制劑可降低AHL合酶的活性，通過與LasR和RhlR結合競爭性抑制AHL產生，從而阻斷毒力因子的表達[19]。該方法能預防或減少病原菌生物膜形成，降低細菌毒力，降低產生抗生素耐藥性的風險。

1.3 生物膜形成當PA粘附于宿主表面時，細菌可以向胞外分泌粘性物質，將形成的微菌落包裹并在QS的調節下逐漸形成生物膜[9]。生物膜除了可以牢固粘附于宿主細胞表面之外，還可以分泌胞外聚合物和毒力因子，不但使生物膜具有自身的空間結構，保護細菌免受宿主的免疫攻擊，還能改變菌體結構或表型，逃避免疫識別，因此生物膜可能是PA角膜炎產生抗生素抗藥性，導致治療效果不佳的主要原因[20]。細菌性角膜炎傾向于急性感染，而生物膜多引起持續性感染，因此以往對于生物膜的形成在角膜炎致病機制中的研究較少。Saraswathi等[21]建立PA角膜炎小鼠模型，并通過裂隙燈、共聚焦顯微鏡及電鏡等多種成像方法證明PA感染角膜后可形成成熟的細菌生物膜，并且成像結果顯示生物膜發育的所有階段都存在于該動物模型中。該研究為生物膜的形成是PA角膜炎的致病因素提供了強有力的證據。

生物膜的形成主要依賴于PA群落的粘附，所以目前普遍認為主要以減少PA粘附及抑制群體感應是抑制生物膜形成的有效策略[22]。噬菌體通過裂解感染的PA，降低生物膜的活性，也可成為輔助治療角膜炎的手段之一。Fukuda等[23]建立重度感染的PA角膜炎小鼠模型，隨后使用噬菌體在受損角膜局部給藥，接受噬菌體治療的小鼠比未接受噬菌體治療的病程明顯縮短，且炎癥反應也更輕，顯示了未來局部使用噬菌體作為抗生素替代品治療角膜炎的可能性。

2 PA的毒力因子

毒力因子對PA的致病性也有影響。PA釋放毒力因子可損傷宿主細胞正常結構，破壞宿主的生理功能。內毒素是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分,主要是LPS介導PA侵犯角膜，在細菌粘附、生物膜形成、誘導炎癥因子表達中起作用。但是PA所分泌的胞外產物和毒素才是造成角膜炎病情發展迅速的重要原因。除了毒力因子本身對角膜造成直接損傷外，這些成分還可以使角膜蛋白被分解，造成角膜溶解，引起免疫應答等介導損傷[24]。在已有的研究報道中可證明PA的Ⅱ型分泌系統、Ⅲ型分泌系統及其毒力因子(即效應蛋白)是PA角膜炎的致病機制之一。

2.1 Ⅱ型分泌系統Ⅱ型分泌系統負責釋放分泌性毒力因子，如LasB、ToxA、綠膿菌素等。LasB可分解彈性蛋白、纖維蛋白和角膜基質成分中的膠原蛋白，降解宿主免疫系統內的組分。還能進一步激活角膜基質的金屬蛋白酶和激肽釋放酶，快速降解細胞外基質，破壞角膜組織，促血管通透性增加，引起組織水腫[25]。ToxA一方面使細胞蛋白質合成障礙，另一方面與抗體結合加重角膜組織損傷。Hazllet等[26]通過電鏡觀察到ToxA對角膜上皮、內皮細胞有細胞毒作用，導致基質細胞腫脹，在造成角膜潰瘍起到了重要作用。在Caballero等[27]的研究中，蛋白酶Ⅳ已被證明是PA角膜炎的關鍵毒力因子，可以直接毒性損傷角膜，并且能降解宿主免疫過程中起重要作用的免疫蛋白，如補體和IgG，造成細菌感染[25]。

2.2 Ⅲ型分泌系統Ⅲ型分泌系統具有類似針管的特殊結構，Ⅲ型分泌蛋白(即毒力因子)可直接從細菌胞質進入細胞，發揮毒力，引起急性角膜炎癥[28]。Ⅲ型分泌系統分泌的效應蛋白主要是4種胞外酶，與眼損傷最為相關的是ADPR轉移酶ExoS和脂酶ExoU[29]。ExoS可減弱巨噬細胞對PA的清除，并且ExoS可干擾宿主細胞的信號傳導，誘導中性粒細胞凋亡而抑制對細菌的殺傷，增強PA對角膜的侵襲力[30]。ExoU自身具有較強破壞性，對組織危害極大。活化后的ExoU注入角膜上皮細胞時，引起上皮細胞急性細胞毒反應[24]，導致細胞快速裂解，釋放大量炎癥因子，破壞大量角膜組織。并且ExoU還與細菌的免疫逃避有關，該酶攻擊中性粒細胞，抑制中性粒細胞在炎癥部位的募集，造成局部免疫抑制[31]。近年來已發現多種小分子抑制劑或抗體疫苗[32]。通過調控分泌系統的轉錄過程，破壞轉位裝置，影響蛋白功能，直接或間接影響分泌系統的表達或功能，減輕PA感染對角膜造成的病理損傷。

3 宿主免疫反應

在PA感染后期，即使及時使用抗生素進行針對性治療，但角膜仍可出現明顯的上皮水腫基質潰瘍,繼而導致角膜組織破壞，視力喪失。角膜浸潤主要是感染早期的PA致病因子在起作用，而組織降解、角膜穿孔等過程更多是由宿主的炎癥反應引起的。炎癥反應是細菌清除的必要環節，可過度的宿主炎癥會加重病理組織損傷[33]。

3.1 固有免疫角膜固有免疫防御對阻止細菌入侵眼部至關重要。角膜上皮不僅是抵御細菌損害的物理屏障，角膜上皮細胞和角膜基質成纖維細胞還可以表達Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)。PA感染后，Toll樣受體識別細菌的毒力因子，激活促炎細胞因子的快速產生，例如IL-1、IL-6等。其中IL-1是角膜炎癥反應起始因子之一，在Yan等[34]建立的動物模型中可發現IL-1活性升高與炎癥程度相關，IL-1介導宿主防御的急性炎癥反應，具有較強的破壞作用。IL-6被認為在PA感染早期對保護角膜起重要作用。IL-1能刺激IL-6產生，IL-6可調節白細胞募集到炎癥部位，并調節補體的表達，殺傷細菌控制感染。Cole等[35]已經證明IL-6在PA感染的角膜組織中快速上調，并且IL-6基因缺陷型小鼠與野生型相比，病程延長，炎癥反應更重，預后更差。IL-1、IL-6等可以趨化多核中性粒細胞(polymorphonuclear,PMN)向病變部位集中，募集的PMN浸潤于感染角膜，引起炎癥反應以清除細菌。但過量PMN浸潤可使病情惡化，促角膜穿孔：(1)PMN產生的活性氧物質可對角膜上皮和內皮細胞進行氧化攻擊，導致角膜水腫。(2)PMN可釋放金屬蛋白酶，活化后使角膜基質降解，導致潰瘍[24]。

3.2 特異性免疫機體抵抗PA的特異性免疫主要是由CD4+T細胞介導。CD4+T輔助細胞(Th細胞)可能的分化途徑包括Th1、Th2和Th17細胞。Th1細胞分泌IL-12、IFN-γ，激活細胞免疫應答，產生的細胞因子可以活化巨噬細胞，增強巨噬細胞的殺傷效力，并參與CD8+T細胞增殖，發揮T細胞的細胞毒性，清除病原體。Th1細胞在促殺菌活性的同時，不斷募集的PMN促進炎癥反應可導致組織損傷，嚴重時可發展至不可逆階段[36]。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10，引起體液免疫應答。這類細胞因子以抗炎為主，IL-4能夠抑制角膜新生血管的產生，IL-10能抑制活性氧物質所產生的氧化作用，并拮抗Th1型反應所引起的過度炎癥反應對組織的破壞作用[37]，Th2細胞減輕了自身抗原所產生的免疫反應，但是卻容易使病程遷延，造成慢性感染。在相關的研究中表明，傾向于Th1型反應的C57BL/6小鼠角膜感染PA后在感染早期即可出現角膜混濁，角膜基質及前房有大量炎性細胞浸潤，病情較重，進展迅速，極易導致角膜穿孔。BALB/c小鼠更傾向于Th2型反應，感染后相較于C57BL/6小鼠病程更長，但角膜潰瘍或穿孔的發生率卻明顯更低[38]。因此Th1和Th2型免疫應答的促炎與抗炎平衡對角膜炎的病程發展起到重要作用。Th17細胞分泌IL-17協助PMN遷移至組織損傷部位，促局部炎癥加重。也有研究者提出Th17應答通過促炎細胞因子IL-17與PA慢性感染中的Th2途徑合并[10]，與持續性的炎癥反應有關。針對細胞因子，使用免疫調節劑調節免疫應答，能減輕炎性細胞浸潤對角膜的損害[39]。基質金屬蛋白酶抑制劑能抑制PA介導的對角膜細胞的膠原降解。IL-6受體阻斷劑現已應用于IL-6介導的葡萄膜炎、角膜燒傷等眼部疾病[40]，局部應用IL-1β的天然抑制劑IL-1Ra，可抑制角膜的炎癥細胞浸潤[41]。

4 結語

PA角膜炎發病率高且起病急、發展快、易致盲。局部使用抗生素是治療的首選方法，然而，逐漸增加的抗生素耐藥性為角膜炎的治療增加了難度。當PA接觸受損角膜表面后，可粘附于角膜進行繁殖，產生粘附因子作用于角膜造成急性感染，并通過群體感應系統和蛋白質分泌系統釋放毒力因子，加重角膜損傷。浸潤細胞快速募集至感染部位引起炎癥反應清除細菌，除此之外，還可以協助激活特異性免疫反應。特異性免疫應答在清除細菌的同時，過強的炎性作用會加重炎性細胞浸潤造成角膜組織的溶解壞死，相反，抗炎作用過強使未被清除的PA可繼續生長繁殖形成生物膜，造成持續性的炎癥和損傷，因此特異性免疫應答的促炎抗炎平衡也極為重要，綜上所述，PA角膜炎的發生發展及病情轉歸預后受PA致病因素與宿主免疫應答共同影響。明確PA角膜炎的發病機制并進行深入研究，阻斷發病過程中的各個環節，尋找相應的抑制劑將有助于推動替代治療的發展，為其治療提供新的策略。