糖尿病角膜上皮維持穩(wěn)態(tài)的機(jī)制探究

李秋玉，彭佳欣，邵 毅

0 引言

2型糖尿病(T2DM)的特點(diǎn)是胰島素調(diào)節(jié)紊亂和血糖控制受損[1]。目前T2DM被認(rèn)為是一種全球性的流行病，全球有超過4億人患有T2DM[2]。血糖自動(dòng)調(diào)節(jié)功能的減弱會(huì)引發(fā)心血管疾病、腎病和神經(jīng)病變等一系列嚴(yán)重的健康問題[3-4]。血糖失調(diào)容易使眼睛出現(xiàn)多種并發(fā)癥，人們研究最為深入的是糖尿病性視網(wǎng)膜病變。由于慢性高血糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血，促進(jìn)脆弱血管的增生，從而最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷，增加視網(wǎng)膜脫離的風(fēng)險(xiǎn)。除了視網(wǎng)膜損傷，糖尿病患者還易患青光眼和白內(nèi)障[5-6]。此外，干眼是與糖尿病患者相關(guān)的一種共病狀態(tài)，可進(jìn)一步加重眼表損害[7]。

角膜上皮是天然免疫系統(tǒng)的第一道防線，保護(hù)眼睛免受微生物入侵。角膜上皮的獨(dú)特之處在于它是無血管的。因此，角膜上皮不直接從血液吸收葡萄糖，而是通過房水吸收葡萄糖。葡萄糖也存在于淚液中，但淚液中的葡萄糖水平遠(yuǎn)低于房水和血清中的葡萄糖水平[8]。在糖尿病患者中，角膜上皮暴露在高水平的葡萄糖中。除了慢性高血糖外，角膜還會(huì)受到高度的炎癥和氧化應(yīng)激的影響[9]。角膜并發(fā)癥是很常見的，存在于40%～70%的糖尿病患者中[4，10]。糖尿病性角膜病變的并發(fā)癥包括：從淺表性點(diǎn)狀角膜炎到復(fù)發(fā)性角膜糜爛和持續(xù)性上皮缺損。后者的特征是基底膜的喪失和基質(zhì)潰瘍。在疾病控制不佳的情況下，角膜上皮的屏障功能會(huì)逐漸減弱，淺表性點(diǎn)狀角膜炎正是在角膜上皮的緊密屏障功能受到破壞時(shí)發(fā)生的。糖尿病患者由于基底神經(jīng)叢感覺神經(jīng)纖維密度降低，其角膜敏感度也降低[11]。角膜神經(jīng)支配的喪失被認(rèn)為是基底角膜上皮細(xì)胞被破壞和角膜上皮變薄的基礎(chǔ)。

角膜損傷后，需要高效和高度協(xié)調(diào)的傷口愈合機(jī)制以保持其透明和恢復(fù)屏障功能，位于邊緣基底層的干細(xì)胞可以提供必要的細(xì)胞來補(bǔ)充受損的上皮細(xì)胞[12]。上皮細(xì)胞修復(fù)初始的潛伏期以細(xì)胞脫落和基底層重組為特征。隨后的細(xì)胞遷移和增殖的線性愈合階段導(dǎo)致傷口閉合。基于分子水平的修復(fù)過程是復(fù)雜的，部分受生長因子、同源受體及其下游效應(yīng)通路的調(diào)控。越來越多的證據(jù)表明，類似于糖尿病，細(xì)胞外富含葡萄糖的培養(yǎng)可以誘導(dǎo)細(xì)胞高血糖狀態(tài)，改變這些通路中的關(guān)鍵因子的表達(dá)。本篇綜述將總結(jié)目前對于高血糖對角膜上皮調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)和修復(fù)創(chuàng)傷的分子機(jī)制的影響的認(rèn)識(shí)，并進(jìn)一步討論這些機(jī)制中相關(guān)通路作為靶點(diǎn)用于治療和保護(hù)糖尿病患者角膜的潛力。

1 糖尿病性角膜上皮維持穩(wěn)態(tài)的可能機(jī)制

1.1 EGFR介導(dǎo)ERK和PI3K/Akt的磷酸化表皮生長因子受體(EGFR)在維持上皮細(xì)胞的存活、增殖和分化方面有著廣泛的作用。EGFR通過與配體結(jié)合二聚后觸發(fā)自磷酸化和下游信號通路的啟動(dòng)[13]。角膜上皮損傷后，表皮生長因子受體有明顯的代償性升高，其下游效應(yīng)因子磷酸化，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/Akt，以促進(jìn)傷口愈合[14]。

與體外研究一致，Yu等證明了1型糖尿病鏈脲佐菌素(STZ)大鼠角膜上皮中EGFR介導(dǎo)的PI3K/Akt磷酸化減少[15]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)相關(guān)死亡啟動(dòng)子(BAD)是Akt下游的促凋亡蛋白，并在ERK和Akt磷酸化時(shí)失活。EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的減少使BAD的活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少和傷口愈合明顯受損的促凋亡狀態(tài)。PI3K/Akt途徑也參與促進(jìn)細(xì)胞遷移。在糖尿病大鼠角膜中，弱磷酸化Akt在基底上皮細(xì)胞中明顯存在。這一發(fā)現(xiàn)與報(bào)道的傷口愈合延遲一致[15]。

1.2 抑制IGBP-3的合成胰島素受體(INSR)和胰島素樣生長因子1型受體(IGF-1R)與細(xì)胞外配體IGF-1、IGF-2或胰島素結(jié)合，誘導(dǎo)其自磷酸化和銜接蛋白的募集以觸發(fā)下游信號級聯(lián)[16-17]。INSR和IGF-1R在體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞和原位培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞中均有表達(dá)[18]。由于其高度的結(jié)構(gòu)相似性，INSR和IGF-1R已被報(bào)道形成雜交受體(hybrid-R)。在糖尿病組織中可觀察到hybrid-R的表達(dá)增加，其被認(rèn)為在介導(dǎo)配體特異性和胰島素非敏感性方面起著關(guān)鍵作用[19]。已經(jīng)確定角膜上皮細(xì)胞中存在hybrid-R，并且表明hybrid-R主要對IGF-1敏感，而對胰島素不敏感[18]。

有相關(guān)研究表明，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)與IGF1和IGF-2能夠高親和力結(jié)合，從而阻斷IGF-1R的激活[20]。IGFBP-3作為血清中主要的IGF結(jié)合蛋白，其功能是延長IGF-1的半衰期。這在糖尿病患者中非常重要，與非糖尿病對照組相比，糖尿病患者淚液的IGFBP-3水平增加了近3倍[21]。

當(dāng)端粒酶永生化人角膜上皮細(xì)胞(hTCEpi)在細(xì)胞外高水平葡萄糖存在下培養(yǎng)時(shí)，IGFBP-3的分泌也同樣增加。這表明，在同一細(xì)胞系中，急性和慢性暴露在高糖環(huán)境中都會(huì)改變IGF-1的含量。在角膜上皮中，IGF-1刺激Akt，并通過IGF-1R的激活促進(jìn)細(xì)胞生長[18]。

用重組IGF-1和IGFBP-3治療hTCEpi，確定二者在人類糖尿病患者淚液中的比例，減緩了IGF-1R的磷酸化和活化，對糖尿病患者配體利用率降低導(dǎo)致IGF-1R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減少，有助于糖尿病角膜上皮病變這一觀點(diǎn)具有一定的支持作用[22]。

1.3 增加TGFβ的分泌轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)是一種介導(dǎo)多種細(xì)胞活動(dòng)的細(xì)胞因子，TGFβ在多種成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，并參與角膜組織修復(fù)[23]。TGFβ家族中存在3種不同的TGFβ亞型，在角膜上皮中均發(fā)揮一定的作用[24]。角膜上皮對TGFβ的作用很敏感。正常人和大鼠角膜損傷后，角膜上皮TGFβ3表達(dá)上調(diào)。在STZ糖尿病大鼠模型中，不存在這種上調(diào)。使用結(jié)膜下注射的方式向非糖尿病大鼠角膜中注射siRNA寡核苷酸，敲除TGFβ3能顯著減弱上皮表面修復(fù)。此外，與未經(jīng)治療的對照組相比，將TGFβ3注射到1型STZ小鼠模型和2型Goto-Kakizaki大鼠模型均能加速角膜上皮愈合[25]。

1.4 上調(diào)Serpine1的表達(dá)人纖溶酶原激活物抑制劑1(Serpine1)，具有高度創(chuàng)傷誘導(dǎo)性，是TGFβ信號傳導(dǎo)的已知靶點(diǎn)[26]。Serpine1主要作為組織和尿激酶纖溶酶原激活物(tPA和uPA)的抑制物發(fā)揮作用，并介導(dǎo)細(xì)胞粘附、遷移、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移[27]。在人類未轉(zhuǎn)化的角膜上皮細(xì)胞中，Serpine1促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞遷移，并在達(dá)到融合時(shí)促進(jìn)隨后的粘附[28]。如Sun等[29]所證明的，在創(chuàng)傷部位近端的小鼠角膜上皮中，Serpine1的表達(dá)顯著上調(diào)。然而，在STZ小鼠中，與TGFβ類似，高血糖抑制了這種傷口愈合誘導(dǎo)的上調(diào)。與此一致，注射抗Serpine1抗體也可延遲非糖尿病角膜上皮的傷口愈合，而外源性補(bǔ)充Serpine1可使受損的糖尿病角膜上皮的傷口愈合恢復(fù)到正常水平。

1.5 增加HGF的分泌肝細(xì)胞生長因子(HGF)和分散因子(SF)是能夠結(jié)合原癌性受體c-met，誘導(dǎo)多種類型組織的細(xì)胞遷移和增殖的配體，包括角膜上皮細(xì)胞。Kakazu等[30]證明HGF通過激活PI3K/Akt通路促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞存活。在角膜損傷的小鼠模型中，Omoto等[31]發(fā)現(xiàn)用HGF治療不僅能促進(jìn)增殖，而且抑制炎癥。Saghizadeh等[32]使用一種器官培養(yǎng)模型來評估HGF在角膜上皮中的表達(dá)。在他們的報(bào)告中，糖尿病患者c-met的下調(diào)對c-met配體HGF的敏感性產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，HGF表達(dá)的增加可能是糖尿病引起的c-met衰減時(shí)的一種嘗試性代償反應(yīng)。

利用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將c-met基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至器官培養(yǎng)的糖尿病患者角膜中，進(jìn)一步證實(shí)了c-met活化在糖尿病患者中的作用。在這項(xiàng)研究中，c-met的異位表達(dá)恢復(fù)了特定生長因子及其受體的組織學(xué)染色模式，并改善了角膜傷口愈合[32]。與糖尿病類似，特異性c-met抑制劑PHA 665752損害角膜傷口愈合，這是由于c-met可介導(dǎo)促增殖PI3K/Akt途徑的激活[32]。除了增殖，c-met還可誘導(dǎo)p38 MAPK磷酸化，這是角膜上皮細(xì)胞遷移所必需的[33]。這已在一個(gè)器官培養(yǎng)的糖尿病角膜模型中得到證實(shí)，表明c-met誘導(dǎo)的p38 MAPK磷酸化受損是糖尿病性角膜病變的關(guān)鍵途徑。

1.6 激活晚期糖基化終產(chǎn)物受體合成晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的積累也被認(rèn)為會(huì)引發(fā)糖尿病并發(fā)癥[34]。與非糖尿病健康對照組相比，在糖尿病患者的淚液中檢測到晚期糖基化修飾蛋白含量的升高[35]。現(xiàn)有證據(jù)還表明，糖尿病患者角膜上皮以異常高的速率累積晚期糖基化終產(chǎn)物，這可能有助于糖尿病性角膜病變的發(fā)展[7,31]。

Shi等[36]利用人端粒酶永生化角膜緣上皮細(xì)胞系(HUCLs)，用經(jīng)AGEs修飾的牛血清白蛋白(BSA)處理HUCL細(xì)胞。他們的發(fā)現(xiàn)表明，用AGE-BSA處理HUCL細(xì)胞可誘導(dǎo)凋亡，AGE-BSA上調(diào)了AGE受體(RAGE)的表達(dá)，并且加入阻斷RAGE的抗體抑制了活性氧(ROS)的產(chǎn)生和凋亡。

據(jù)報(bào)道，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠淚腺中存在高水平的AGEs[37]。淚腺中的AGEs升高與淚腺重量減輕和炎癥增加有關(guān)。據(jù)推測，AGEs可能通過使淚腺分泌淚液減少而導(dǎo)致角膜功能障礙。這會(huì)導(dǎo)致干眼癥，并進(jìn)一步引發(fā)炎癥和損害角膜表面。

1.7 增強(qiáng)去乙酰化酶1的表達(dá)去乙酰化酶1(SIRT1)是一種Ⅲ類組蛋白/蛋白脫乙酰酶(HDAC)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和代謝[38]。SIRT1作為一種脫乙酰酶，通過p53的脫乙酰作用介導(dǎo)細(xì)胞存活。此外，它在葡萄糖代謝、胰島素分泌和胰島素敏感性方面也可能發(fā)揮一定的作用[39-40]。有關(guān)胰島素敏感性的證據(jù)來自于對人肝癌(HepG2)細(xì)胞和永生化成肌細(xì)胞系(C2C12)的研究，其中SIRT1下調(diào)與胰島素敏感性降低相關(guān)。同樣，在HepG2細(xì)胞中敲除SIRT1基因后胰島素敏感性減弱。與此相反，用已知的SIRT1激活劑白藜蘆醇進(jìn)行治療，上調(diào)在C2C12肌管中的SIRT1，這使得胰島素抵抗培養(yǎng)模型和2型糖尿病高脂小鼠的胰島素敏感性恢復(fù)[41]。

在體外和體內(nèi)模型中，當(dāng)暴露于高糖水平時(shí)，角膜上皮中的SIRT1表達(dá)降低，從而減少傷口愈合。在人角膜上皮細(xì)胞系(THCE)中，創(chuàng)傷愈合能力通過腺病毒介導(dǎo)的SIRT1的過表達(dá)得以恢復(fù)[42]。這是通過降低p53的去乙酰化，降低IGFBP-3的表達(dá)，增加IGF-1R的表達(dá)和增加Akt的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。如前所述，IGFBP-3在糖尿病患者淚液中增加，而IGFBP-3與IGF-1在糖尿病患者淚液中的比例足以阻斷IGF-1與IGF-1R的結(jié)合。

細(xì)胞內(nèi)IGFBP-3與p53乙酰化有關(guān)。因此，在角膜上皮中，SIRT1可能通過p53的乙酰化/去乙酰化和IGFBP-3含量的控制來調(diào)節(jié)IGF-1R/Akt信號通路。除了下游介質(zhì)外，還研究了SIRT1的上游調(diào)節(jié)。Gao等[43]利用小鼠角膜緣/角膜上皮細(xì)胞系，報(bào)道了某些micro-RNAs(miRNAs)在抑制SIRT1中的作用，miR-204-5p是負(fù)責(zé)基因調(diào)控的較小的非編碼RNA分子。他們發(fā)現(xiàn)，與非糖尿病對照組相比，miR-204-5p在糖尿病模型中增加了5倍。使用miRNA拮抗劑敲除miR-204-5p可增強(qiáng)SIRT1的表達(dá)，并在高血糖狀態(tài)下恢復(fù)細(xì)胞周期進(jìn)程。這使得角膜上皮傷口愈合的增加，與先前上調(diào)SIRT1的表達(dá)促進(jìn)糖尿病性角膜上皮修復(fù)的研究相符合[42-43]。

1.8 神經(jīng)激肽1與其配體P物質(zhì)相互作用角膜神經(jīng)支配的喪失對角膜上皮表面有顯著影響。有研究表明，角膜中的感覺神經(jīng)元中存在神經(jīng)激肽1受體(NK1R)，它是一種主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)中的G蛋白偶聯(lián)受體。P物質(zhì)是一種屬于速激肽家族的神經(jīng)肽，可以激活NK1R[44]。Yang等[45]首次報(bào)道在C57BL/6糖尿病小鼠局部應(yīng)用P物質(zhì)，可以促進(jìn)角膜上皮創(chuàng)口愈合。他們利用TKE2小鼠角膜上皮細(xì)胞系，進(jìn)一步證明，在高糖培養(yǎng)中P物質(zhì)通過EGFR影響上皮細(xì)胞的遷移和增殖，從而激活A(yù)kt和SIRT1。NK1R拮抗劑L-733060的加入減弱了P物質(zhì)的作用，表明NK1R可能是靶點(diǎn)。同樣，在正常小鼠中添加L-733060會(huì)減弱EGFR、Akt和SIRT1的激活，降低角膜敏感度，從而促進(jìn)上皮傷口愈合。基于這些發(fā)現(xiàn)，作者得出結(jié)論，在角膜上皮中，NK1R是由角膜神經(jīng)分泌的P物質(zhì)所激活的[45]。而神經(jīng)元本身具有重要功能，如介導(dǎo)反射和調(diào)節(jié)淚液分泌， P物質(zhì)與NK1R的相互作用表明了角膜神經(jīng)支配在維持角膜上皮完整性中的重要作用。

1.9 抑制基質(zhì)金屬蛋白酶以保護(hù)基膜基底膜結(jié)構(gòu)和成分以及細(xì)胞間粘附的改變是糖尿病性角膜病變的病理生物學(xué)基礎(chǔ)。Tabatabay等[46]的早期研究通過電子顯微鏡觀察糖尿病供體角膜組織，發(fā)現(xiàn)基底膜的改變和半橋粒數(shù)量減少，這可能是基底上皮細(xì)胞粘附力減弱的原因。同樣，高血糖培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞也顯示出信息水平的降低，表明暴露于高糖的角膜上皮細(xì)胞表現(xiàn)出基底膜分泌異常[47]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是參與基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)降解主要的酶。Saghizadeh等[48]在器官培養(yǎng)模型中的研究表明，MMP-3和MMP-10以及組織蛋白酶F的表達(dá)和活性在糖尿病角膜上皮中上調(diào)。正常條件下在成人組織中MMPs的表達(dá)通常是低到不存在的[49]。糖尿病角膜中MMP的表達(dá)增加可能在一定程度上導(dǎo)致角膜上皮基底膜的破壞，異常高水平的MMPs也會(huì)損害上皮傷口的愈合。

2 總結(jié)與展望

角膜病變是糖尿病最常見的眼部并發(fā)癥，可能導(dǎo)致視力下降甚至喪失。在角膜上皮的創(chuàng)傷愈合過程中，增殖、遷移和分化是不可缺少的步驟。本篇綜述從細(xì)胞水平總結(jié)了角膜上皮調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵穩(wěn)態(tài)過程的許多潛在的分子途徑，通過EGFR介導(dǎo)ERK和PI3K/Akt的磷酸化，抑制IGBP-3的合成，增加TGFβ的分泌，增加HGF分泌，激活晚期糖基化終產(chǎn)物受體合成，上調(diào)Serpine1的表達(dá)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶以保護(hù)基膜，這些因素中的任何一個(gè)都是可能的機(jī)制，但也可能包含多種因素的協(xié)同作用。隨著對角膜病變的研究越來越深入，各種作用機(jī)制的具體貢獻(xiàn)將得到進(jìn)一步闡明。但對于充分了解高血糖、炎癥和氧化應(yīng)激對糖尿病角膜上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞是否具有重疊作用，我們?nèi)杂写罅康墓ぷ餍枰觥?/p>