miR-204 和miR-211 下調Arx 基因表達影響胰島素分泌細胞誘導分化進程

王 濤，李 晨，穆長征

錦州醫科大學，遼寧錦州 121013 1 醫療學院；2 組織學與胚胎學教研室

糖尿病是嚴重危及人類健康的疾病之一，患者主要依靠胰島素來控制血糖，不能徹底治愈。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，bMSCs)誘導分化為胰島素分泌細胞(insulinproducing cells，IPCs)并行細胞移植，有望成為糖尿病治療的新方案[1-2]。本研究前期實驗中應用大鼠胰腺損傷提取物將小鼠bMSCs 誘導分化為IPCs[3]，并使用微囊包裹，行腎被膜下移植，對糖尿病小鼠有明顯的治療作用[4]。但這種誘導分化效率不高，甚至影響了以此類干細胞治療糖尿病的臨床應用。許多學者為提高轉化率進行了大量的實驗研究[5-7]，然而，目前有關bMSCs 向IPCs 分化的分子機制研究報告甚少。miRNA 作為一類內源性小的非編碼RNA，不僅在干細胞分化過程中有重要作用，在糖尿病的發生發展過程中也有顯著作用，Arx(Aristaless-related homeobox)是胰腺發育過程中重要的轉錄因子[8-9]，因此IPCs 分化過程中可能有miRNAs 作用于Arx 基因調節分化進程。

材料和方法

1 實驗動物 C57BL/6 小鼠購于中國醫科大學實驗動物部，4 ～ 8 周齡，體質量20 ～ 30 g。

2 主要試劑 miRNAs 模擬物或對照miRNA 購自GenePharma 公司，conophylline 粉末購自BioBioPha公司，SYBR?Premix Ex TaqTM和引物購自TaKaRa公司，兔抗小鼠C 肽抗體以及兔抗小鼠Arx 和Pdx1 抗體均購自Linco 公司，Lipofectamine 3000購自Invitrogen 公司，TRITC-山羊抗兔IgG 抗體以及HRP-山羊抗兔IgG 抗體購自Santa Cruz 公司。

3 bMSCs 培養 取小鼠脫頸處死，70%乙醇浸泡10 min；去除股骨和脛骨處皮毛和肌肉，將股骨和脛骨分離下來；剪掉干骺端，應用注射器吸取培養基，反復沖出骨髓；接種到25 cm2培養瓶內，37℃、5% CO2孵箱中培養；每3 d 換液，達到80%融合，0.25%胰酶消化，按細胞1 ∶2 傳代，記作P1。

4 IPCs 誘導 Conophylline 粉末溶解于少量DMSO中，備用；取P3細胞做誘導分化，培養基中加入0.1 mg/L Conophylline 和10 mmol/L 尼克酰胺 ；孵箱中培養2 周，光鏡下觀察細胞形態。

5 雙硫腙(dithizone，DTZ)染色 向培養瓶內加入10 g/L 的DTZ 工作液，37℃水浴10 min，光鏡下觀察細胞的著色情況(參考Shiroi 等[10]的方法)。

6 免疫熒光化學 取誘導后細胞1 000 r/min 離心；106/mL 細胞濃度涂片，冷空氣中干燥；甲醛固定45 min，PBS 沖洗；0.1% BSA 封閉；滴加兔抗小鼠C 肽抗體(1 ∶200)，室溫孵育1 h，PBS 沖洗；滴加TRITC 標記山羊抗兔IgG 抗體(1 ∶200)；DAPI 復染細胞核。

7 miRNA 預測 采用數據庫miRanda(http://www.microrna.org) 和TargetScan(http://www.targetscan.org)預測能夠與Arx 基因匹配的miRNAs。

8 Real-time PCR 檢測 取誘導3 d、6 d、9 d、12 d和15 d 細胞，提取總miRNA 或總RNA，按照TaKaRa 反轉錄試劑盒說明進行反轉錄，得到的cDNA 樣品稀釋后，加入SYBR?Premix Ex TaqTM和miRNAs引物(通用引物試劑盒自帶)或Arx引物(表1)，進行40 個循環PCR 反應。應用軟件進行定量分析，每次分析設置3 個重復，以3 批不同樣品進行分析。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

9 Western blotting 檢測 取誘導12 d 細胞，利用Lipofectamine 3000 轉染miRNAs 模擬物或對照miRNA 30 nmol/L，24 h 后提取總蛋白，BCA 法計算濃度，制備樣品，行SDS-PAGE 電泳后轉膜，加入兔抗小鼠Arx 和Pdx1 抗體(1 ∶200)，4℃過夜。滴加二抗(1 ∶1 000)搖床1 h，ECL 反應后檢測。

10 統計學分析 使用SPSS23.0 進行統計分析。觀測資料主要為計量數據，均通過正態性檢驗，以表示。兩組間的比較為成組t 檢驗或校正t檢驗(因本研究不關注各組內時間軸上的變化，故未采用重復測量方差分析)。統計推斷的檢驗水準α=0.05。

結 果

1 誘導前后細胞形態學觀察 bMSCs 經多代培養后，細胞形態均一，呈長梭形(圖1A)。誘導分化后的細胞變成圓形、橢圓形(圖1B)，分化效率約30%；DTZ 染色呈陽性，細胞著猩紅色(圖1C)；免疫熒光化學發現分化2 周后的細胞內C 肽表達陽性，顯示紅色熒光(圖1D)。

2 生物信息學預測結果 為尋找靶基因為Arx(NM_007492) 的miRNAs， 分 別 運 用miRanda 和TargetScan 兩個靶基因數據庫進行預測，取交集后，得 到miR-204 和miR-211。TargetScan 顯示miR-204 和miR-211 的靶位點類型均為8mer，“context+ +score”百分數分別為96 和95，表明miRNA 與靶位點互補情況良好。miRanda 顯示miR-204 和miR-211在Arx mRNA 3'UTR上都只有一個靶位點，且二者的靶位點相同，其中miR-204 的mirSVR 得分為-0.955 0，miR-211 的mirSVR 得分為-0.958 2，表明miRNA 與3'UTR 結合情況良好(表2)。

圖 1 誘導前后細胞形態學觀察[標尺：60μm(A、B、C)， 30μm(D、E)] A：光鏡下bMSCs呈紡錘形； B：誘導后細胞變成圓形； C：DTZ染色顯示猩紅色； D：細胞免疫熒光顯示C肽呈陽性表達； E：DAPI標示細胞核Fig. 1 Morphology of cells before or after induction (Bar：60μm[A, B, C], 30μm[D, E]) A: Light micrograph of bMSCs showing spindle cell morphology; B: IPCs have become round after the induction; C: IPCs could be stained scarlet by DTZ; D: The expression of C-peptide is positive by immunofluorescence; E: The nuclei are counterstained using DAPI

3 IPCs 誘導分化過程中miRNAs 與Arx 的表達關系 為檢測Arx mRNA 與調控其表達的miR-204和miR-211 在IPCs 誘導分化過程中的關系，我們應用Real-time PCR 對誘導3 d、6 d、9 d、12 d和15 d 的細胞進行檢測，以3 d 表達量為100%，發現誘導6 d Arx mRNA 的表達量是3 d 表達量的(4.05±1.51)倍，誘導12 d 升至(13.12±3.61)倍，誘導15 d 有所降低但仍是3 d 的(8.25±1.98)倍。而miR-204 的表達量誘導6 d 下降為82.57%±4.91%，誘導15 d 下降至25.73%±7.52%；同樣，miR-211 的表達量誘導6 d 下降為75.46%±3.43%，誘導15 d 下降至29.06%±8.08%(圖2)。結果表明，在IPCs 誘導分化過程中，miR-204 和miR-211 的表達量逐漸降低，而Arx mRNA的表達量逐漸升高。

表2 預測的miRNAs 與Arx 3’UTR 配對關系Tab. 2 Relationship between predicted miRNAs and Arx 3’UTR match

圖 2 誘導過程中miR-204、 miR-211 和Arx mRNA 的相對表達水平Fig. 2 Relative expression levels of miR-204, miR-211 and Arx mRNA during the induction

圖 3 轉染miR-204 和 miR-211對Arx 和Pdx1蛋白表達的影響Fig. 3 Arx and Pdx1 protein expressions were determined after transfection with miR-204 or miR-211 mimic

4 miR-204 和miR-211 過表達對IPCs 誘導分化的影響 為分析miR-204 和miR-211 對IPCs 誘導分化的影響，我們利用Lipofectamine 3000 轉染miRNAs 模擬物或對照miRNA(control 組)進入細胞，24 h 后觀察Arx 蛋白和胰腺祖細胞標志物Pdx1 蛋白的表達情況，發現與對照組的(86.34±5.77)%比較，miR-204 組和miR-211 組的Arx 蛋白相對表達量減少，分別為(25.37±4.17)%和(20.52±3.96)%，差異均有統計學意義(P ＜0.05)。同樣，與對照組的(96.42±4.86)%比較，miR-204 組和miR-211 組的Pdx1 蛋白相對表達量減少，分別為(31.21±5.04)%和(24.93±4.51)%，差異均有統計學意義(P ＜0.05)。由此可見，過表達miR-204 和miR-211 均可下調Arx 基因的表達，進而調節胰島重要轉錄因子(Pdx1)的表達來調控IPCs 的誘導分化進程。見圖3。

討 論

目前，干細胞移植已成為糖尿病臨床研究和治療的關注點，干細胞誘導為IPCs 是關鍵環節之一[11-13]。Sun 等[14]轉染含有Pdx1 的重組載體進入bMSCs，能夠誘導細胞分化為IPCs 且效率高達28%，葡萄糖刺激能夠分泌胰島素且較為敏感，移植細胞到STZ 致糖尿病大鼠血糖迅速下降，但21 d后血糖水平出現反彈。Li 等[15]構建Pdx1 的腺病毒載體，將其轉染進人bMSCs，7 d 后細胞內有胰島素的表達，進一步檢測發現該細胞也表達神經元素3(Ngn3)，但對葡萄糖刺激敏感度較差，移植細胞到STZ 致糖尿病大鼠，2 周后大鼠血糖正常且保持42 d。Yuan 等[16]通過轉染Pdx1 基因進入bMSCs，胰島素釋放試驗發現細胞在葡萄糖刺激下能夠分泌胰島素，雙硫腙染色發現細胞呈猩紅色。以上研究均提示bMSCs 有分化為胰島細胞的潛能，Pdx1 蛋白對bMSCs 胰島向的分化有重要作用，因此本研究除探討靶基因Arx 之外，也檢測了Pdx1蛋白的表達。

本研究發現光鏡下bMSCs 形態均一，呈長梭形，表明分離和培養成功。誘導分化后的細胞變成圓形和橢圓形，DTZ 染色細胞著猩紅色，分化2周后的細胞內C 肽表達陽性，表明誘導效果不錯，且分化效率大約30%。

許多miRNAs 與β 細胞的分化密切相關[17-19]，研究發現在人類胰島發育過程中miR-375 和miR-7 的表達均增加[20]，在體外人胚胎干細胞分化為IPCs 的過程中miR-375 和miR-7 的表達也相應增加[21]。過表達miR-375 的體外實驗也顯示其可以誘導人胎盤來源間充質干細胞分化為IPCs[22]。另外，在miR-26a 轉基因小鼠中胰腺細胞增殖顯著加強，內分泌細胞分化顯著增強，胰島細胞數量顯著增加，miR-26a 能夠靶向胸腺嘧啶核苷糖苷酶(TDG)參與 β 細胞發育[23-24]。miR-124a 在小鼠胚胎胰腺發育后期(胚胎第18.5 d)表達上調，表明其在分化中可能發揮作用，研究發現在MIN6細胞系中miR-124a 能夠靶向轉錄因子叉頭框蛋白A2(Foxa2)，調節胰島素的分泌以及β 細胞的分化[25-27]。以上研究均表明miRNA 在干細胞胰島向分化過程中有重要作用，其主要通過調控重要轉錄因子(靶基因)的表達來實現，因此本研究選擇轉錄因子Arx 基因為切入點。

Arx 基因首次在斑馬魚和小鼠中分離鑒定，是一類含有同源異型結構域蛋白的轉錄因子，其在生長發育中起著關鍵作用，與胰腺和腦發育有關[28-29]。本研究通過Real-time PCR 發現誘導分化過程中Arx mRNA 表達持續增加，至誘導分化12 d 達到峰值，Western blotting 檢測也發現Arx 蛋白的高表達，表明Arx 是IPCs 誘導分化過程中重要的轉錄因子。通過生物信息學預測能夠與Arx 基因匹配的miRNAs，取交集后得到miR-204 和miR-211，Real-time PCR 發現在IPCs 誘導分化過程中miR-204 和 miR-211 的表達量逐漸降低，而Arx mRNA的表達量逐漸升高。過表達miR-204 或miR-211，Western blotting 發 現miR-204 或miR-211 能 夠 下調Arx 蛋白的表達，通過上述兩個實驗可以驗證miRNA 與Arx 基因之間的負性調控作用，且過表達miR-204 或miR-211 后Pdx1 蛋白也下降，表明IPCs 的誘導分化過程受到抑制，推測原因可能是miR-204 或miR-211 通過直接抑制Arx 蛋白的表達，進而間接抑制胰島向分化標志性蛋白Pdx1 的表達，這也說明Pdx1 應該位于Arx 轉錄因子的下游。因此，miR-204 和miR-211 能夠下調Arx 基因的表達，影響IPCs 的誘導分化進程。