缺氧預處理人骨髓間充質干細胞衍生細胞外囊泡的microRNAs 表達譜分析

邊素艷，劉姍姍，劉宏斌，朱啟偉

解放軍總醫院第二醫學中心，國家老年醫學臨床研究中心，心血管內科，北京 100853

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)作為一種多能干細胞，具有多向分化潛能、造血支持、免疫調控和自我復制等特點，且MSC 取材方便、體外擴增容易，免疫源性低，被認為是組織工程研究及轉化的理想種子細胞。機制研究表明，MSC 釋放的細胞外囊泡(extracelluar vesicles，EVs)可能是其與靶器官信號傳遞的重要介質，發揮著促進創傷修復、抗炎、調節免疫等作用，是MSC 組織損傷修復的重要機制之一[1-2]。在不同環境下，MSC 釋放的EVs 中所包含的蛋白質、脂質、mRNA、microRNAs 等內容物不同[3-4]。研究不同應激條件下MSC 釋放EVs 的生物信息分子表達情況，對研究MSC 的功能及分子調控機制，選擇性地改造MSC-EVs，使其具有特殊的功能，具有一定的實用價值。既往研究表明，缺氧(5% O2)預處理能增強臍帶MSC 的增殖、遷移活性，并維持細胞處于未分化狀態[5-7]。缺氧預處理還可提高MSC 在宿主體內的生存和促血管新生能力[5,8]。我們的前期研究也表明，體外培養的MSC(大鼠骨髓MSC、人臍帶MSC)在低氧和無血清預處理后，可以釋放更多的外泌體；而且這種外泌體，與MSC一樣，具有促進體內外血管生成的作用，改善心肌梗死大鼠缺血心肌的血液灌注和心功能[9-10]。為了解缺氧預處理MSC 促進組織修復功能的分子機制，本研究擬對缺氧預處理MSC 分泌的EVs 進行microRNAs 表達譜，以及差異microRNAs 的基因、功能、分子通路等生物信息學分析，為深入研究MSC-EVs 的調控機制提供依據。

材料和方法

1 試劑與儀器 人骨髓MSC 購自上海拜力生物科技有限公司。α-MEM 培養基(Gibico，美國)；胎牛血清(Hyclone，美國)；Trizol(美國英杰生命技術有限公司)；CO2氣體恒溫培養箱及低氧培養箱(Thermo，美國)；R450 型酶標儀(伯樂，美國)；超高速離心機(貝克曼，美國)；7900HT 實時PCR系統(美國應用生物系統)。

2 人骨髓MSC 的培養及缺氧預處理 生長狀態良好的P3 ～ P5 代人骨髓MSC，按照5×106/皿接種于直徑為150 mm 的培養皿中，在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，預先經0.22μm 濾膜過濾，1×105g 離心16 h，去除FBS 中外泌體)的α-MEM 中，37℃、5% CO2、95%濕度下常規培養過夜使細胞貼壁。次日始去除培養基，換用無血清α-MEM 培養基，置于低氧培養箱中(1% O2，5% CO2，94% N2)繼續培養48 h。

3 MSC-EVs 的制備 收集培養48 h 后的MSC 上清，用超速離心方法收集EVs[9]：細胞上清液在4℃以1 500 g 離心5 min 去除細胞碎片及蛋白顆粒，再經0.22μm 濾膜過濾后，于4℃、1×105g 離心60 min，棄上清，得到EVs沉淀，用Apop緩沖液(含5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，136 mmol/L NaCl)清洗2 次，重懸于50μL Apop 緩沖液中，分成5μL 的等份，存儲在-80℃下用于以下實驗。本研究所用EVs 來源于3 個樣本培養的MSC。

4 microRNAs 微陣列分析 用Trizol 試劑從3 個獨立制備的MSC 和MSC-EVs 中分離RNA，然后在7900HT 實時PCR 系統上用TaqMan 低密度陣列(TLDA，Invitrogen，USA) 進行microRNAs 微陣列分析，由上海其明生物技術有限公司完成。根據數據，應用隨機方差模型(random variance model)t 檢驗篩選差異表達的microRNAs。在顯著性分析和誤判率(false discovery rate，FDR)分析之后，根據P ＜0.05 選擇差異表達的microRNAs[11]。

5 差異microRNAs 靶基因的預測 利用TargetScan和miRanda 數據庫，應用生物信息學方法預測microRNAs 的靶基因。TargetScan 預測的靶基因數量為5 270 個，miRanda 預測的靶基因數量為15 663個，將TargetScan 與miRanda 預測的靶基因取交集后得到交集靶基因數量為3 759 個。

6 功能顯著性分析—GO 分析 將兩組之間的差異microRNAs 預測的靶基因基于Gene Ontology 數據庫(簡稱GO 數據庫)進行基因功能注釋，得到靶基因參與的所有功能[12]，而后利用Fisher 精確檢驗和χ2檢驗計算每個功能的顯著性水平(P)和FDR，篩選出靶基因所體現的顯著性功能[13]。顯著性篩選的標準：P ＜0.05，FDR ＜0.05。

7 Pathway 分析 基于KEGG 數據庫，對靶基因利用Fisher 精確檢驗和χ2檢驗，把目標基因參與的Pathway 進行顯著性分析，根據P ＜0.05 進行篩選，得到顯著性的Pathway[14-16]。

8 microRNAs 與交集靶基因的調控網絡(microRNA-Gene-Network) 通過靶基因的功能顯著性分析和Pathway 的顯著性分析，得到顯著性的GO 和Pathway 及其所屬的基因，而后取顯著性GO 所屬靶基因與顯著性Pathway 所屬的靶基因的交集，根據microRNAs 和靶基因的這部分交集的屬性，利用microRNAs 與靶基因之間的靶向調控關系，構建microRNA-Gene-Network。

9 基于靶基因功能分析的網絡構建(microRNAGO-Network) 結合基因功能數據庫和靶向序列分析技術，將上一步分析中得到的顯著性GO 與差異microRNAs 構建MicroRNA-GO-Network，篩選出在實驗處理后的關鍵microRNAs 及microRNAs 調控的靶基因的主要功能。

10 統計學分析 所有結果采用SPSS11.0 軟件進行統計學分析。實驗數據以表示，組間比較采用成組t 檢驗或單因素方差分析。兩分類的差異基因篩選使用隨機方差模型的t 檢驗或F 檢驗。GO、Pathway分析采用Fisher's精確概率檢驗和χ2檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 microRNAs 的表達譜分析 microRNAs 微陣列結果顯示，MSC-EVs 中至少表達223 種microRNAs，MSC 中 至 少 有526 種microRNAs。MSC-EVs 中檢測到的microRNAs 均存在于MSC，但二者microRNAs 表達水平存在差異。與MSC 相比，MSC-EVs 中共有98 種差異表達microRNAs，包括31 種表達上調，67 種表達下調的microRNAs(P ＜0.05，圖1)。前15 位差異表達上調或下調的microRNAs 見表1。

2 差異microRNAs 對應靶基因的顯著性功能分析(GO-Analysis) 顯著性GOs 分析表明，MSC-EVs中上調microRNAs 的顯著性細胞功能包括細胞分化、運輸、MAPK 活性的失活、對刺激的反應、細胞周期等。相反，與下調microRNAs 相對應的重要GOs 包括細胞分化、運輸、細胞周期、對刺激的反應、內吞作用。見圖2。

3 差異microRNAs 對應靶基因的顯著性Pathway分析 對MSC-EVs 差異microRNAs 調控靶基因的Pathway 進行分析，上調microRNAs 調控的重要通路包括局灶性黏附、胰島素信號途徑、erbB 信0號途徑、MAPK 信號途徑、趨化因子信號途徑等。下調microRNAs 調控的重要通路包括MAPK 信號通路、erbB 信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調節、局灶性黏附、mTOR 信號通路等。見圖3。

表1 MSC-EVs 中前15 位差異表達上調或下調的microRNAsTab. 1 The top 15 differentially expressed microRNAs in MSC-EVs compared with MSC

4 microRNAs 靶向調控基因網絡(microRNAGene-Network) 網絡中調控mRNA 最多的前5 位下 調microRNAs 有has-miR-93-5p、has-miR-19b-3p、has-miR-23b-3p、has-miR-34a-5p 和has-miR-185-5p，分別調控193、142、126、102和37 種mRNA；調控mRNA 最多的前5 位上調microRNAs 有has-miR-149-3p、has-miR-4763-3p、has-miR-762、has-miR-4492 和has-miR-3135b，分別調控86、79、63、60 和44 種mRNA。網絡中被microRNAs 調控最多的前5 位靶基因包括RORA、IQSEC2、CBL、DPYSL5、VPS37D，分別由7、7、6、6、6 個microRNAs 調控。見圖4。

圖 1 MSC-EVs和MSC中microRNAs的差異表達譜熱圖。綠色或紅色條分別表示樣品中特異性microRNAs水平下調或上調Fig. 1 A heat map comparing expression of microRNAs between MSC-EVs and MSC. Green or red bars indicate that the level of specific microRNAs in the sample was down-regulated or up-regulated, respectively

圖 2 基于差異microRNAs對應靶基因的GO分析(GO-Analysis)。縱軸是差異功能名稱，橫軸是功能的豐度Fig. 2 GO analysis based on differential microRNAs targeted genes. The vertical axis is the GO category, and the horizontal axis is the enrichment of GO

圖 3 基于差異microRNAs對應靶基因的Pathway分析(Pathway-Analysis)。縱軸是差異功能名稱，橫軸是通路的豐度Fig. 3 Pathway analysis based on differential microRNAs targeted genes. The vertical axis is the Pathway category, and the horizontal axis is the enrichment of Pathway

5 microRNAs 靶向調控功能網絡(microRNA-GONetwork) 對差異microRNAs 與第四步中的顯著性功能進行迭代相關，構建microRNAs 與靶基因功能的網絡，得到在網絡中起核心調控作用的microRNAs 及其調控的關鍵功能。網絡中關鍵的前5 位microRNAs 包 括hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-23b-3p、hsamiR-4763-3p，分別參與調控51、42、42、42、33種細胞功能。細胞黏附、細胞分化、細胞增殖調節、轉運和誘導凋亡是被microRNAs 調控最多的前5 位細胞功能，分別由23、21、19、18、16 個microRNAs 調控。見圖5。

圖 4 microRNAs基因調控網絡(microRNA-Gene-Network)。圖中圓角矩形代表microRNA(紅色標注的是上調，藍色標注的是下調)，灰色圓圈代表gene，直線代表microRNA與gene的調控關系Fig. 4 microRNA-gene-network. In the figure, the rounded rectangle nodes represent microRNAs (red indicates up-regulation, blue indicates down-regulation), gray circle node represents gene, and straight lines describe regulatory relationship between microRNA and gene

圖 5 microRNAs功能調控網絡(microRNA-GO-Network)。圖中正方形和六邊形代表microRNA(紅色標注的是上調，藍色標注的是下調)，灰色圓圈代表GO功能，直線代表microRNA與GO的調控關系Fig. 5 microRNAs-GO-Network. In the figure, the square and hexagon represent microRNAs (red indicates up-regulation, blue indicates down-regulation), gray circle node represents GO, and straight lines describe regulatory relationship between microRNA and GO

討 論

本研究分析了缺氧預處理的MSC-EVs 的microRNAs 表達譜，并通過生物信息分析，篩選出一些缺氧預處理后MSC-EVs 中差異表達的microRNAs，預測了它們的靶基因，及其調控的細胞功能及分子通路，為進一步研究缺氧預處理后MSC 的組織修復功能及相關機制，尋找替代MSC 移植的功能增強型EVs，提供了生物信息學研究基礎。

越來越多的研究表明，MSC 的再生作用可能由其來源的EVs(包括微泡或外泌體等)介導完成，如MSC-EVs可促進急性腎損傷小鼠的功能修復[17]，促進肝切除大鼠的肝再生[18]，縮小缺血心臟的梗死面積[19]、調節心肌重塑[20]。EVs 可能通過受體-配體相互作用，傳遞表面受體、生物活性脂質、信號分子、microRNAs、mRNA 等至靶細胞，從而調控靶細胞的功能[21-24]。

EVs 介導的遺傳物質轉移被認為是一種新的細胞間遺傳交換機制[3]。Collino 等研究發現成人骨髓和組織特異性MSC 可選擇性分泌microRNAs，上百個與不同功能相關的基因被報道參與這一過程。然而，EVs 中的內含物并不是隨機的，細胞在不同的狀態分泌的EVs 組成成分不同，這一過程由復雜的分選系統來調控[4]。MSC 分泌EVs 也較為復雜，受培養條件、細胞活力等多種因素影響。

氧濃度是影響MSC 細胞生物學的一個重要因素[25]。缺氧刺激使細胞處于活化/應激狀態，可分泌大量的外泌體[9,26]。缺氧可促進細胞釋放一種救命信號，通過機制復雜的轉錄因子的網絡調控和信號蛋白表達，以促進機體啟動緊急修復程序，調節細胞代謝、增殖，DNA 修復和凋亡等適應性改變。其中，較為重要的是缺氧可引起一系列特殊的microRNAs 表達改變(被稱為Hypoxamirs)，表現在：1)缺氧對Hypoxamirs 轉錄的調控：在缺氧條件下，缺氧誘導因子(Hypoxiainducible factor，HIF)等轉錄因子被上調，并直接激活部分Hypoxamirs 的轉錄，或選擇性抑制部分Hypoxamirs。2)低氧也通過表觀遺傳調控如控制特異性microRNAs 轉錄的DNA 去甲基化。3)缺氧可調節控制microRNAs 成熟和活性中轉錄后事件的關鍵蛋白的活性。提示缺氧是microRNAs 生物生成和功能的重要調控因子[27]。

本研究發現，缺氧預處理MSC 所分泌的EVs中microRNAs 表達譜與母細胞中microRNAs 存在差異。MSC-EVs 中表達223 種microRNAs，而MSC 中表達526 種microRNAs。除了表達種類不同外，表達量存在顯著差異的microRNAs 有98 種，包括31 種表達上調，67 種表達下調的microRNAs。有趣的是，MSC-EVs 中所有microRNAs 均來自MSC，但具有一定的選擇性，這可能與HIF 等轉錄因子對Hypoxamirs 轉錄、成熟和功能的調控有關。這些差異表達的microRNAs 可能與缺氧預處理后MSC 的功能相關。

繼而，我們對差異microRNAs 預測的靶基因進行了后續功能學分析，結果顯示EVs 中差異microRNAs 中優先調控的生物學功能包括細胞黏附、細胞分化、細胞增殖調節、轉運和凋亡，這些與細胞命運和分化有密切關系，提示其在組織損傷的修復中起重要作用。而這些功能的實現，最可能參與的調控通路有局灶性黏附、erbB 信號途徑、MAPK 信號途徑等。

細胞與細胞、細胞與基質或細胞-基質-細胞間黏附功能，是細胞識別、信號轉導、活化增殖與分化以及細胞的伸展與轉移的重要分子基礎，參與免疫應答、細胞遷移等一系列重要生理和病理過程。細胞遷移增加可導致MSC 在組織修復和再生過程中的募集。絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)是廣泛存在于動植物細胞中的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。其作用主要是將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞的生物化學反應(增殖、分化、凋亡、應激等)。研究表明，MAPK 通路在應激條件下大大被激活，但在免疫反應和調節細胞生存分化方面也具有重要作用，使細胞能夠解析各種外部信號，并通過不同的生物效應來適當反饋[28]。erbB 蛋白屬于跨膜酪氨酸激酶的EGF 受體家族成員。在應激狀態中，erbB 信號通路被激活并發生信號的轉導，參與細胞的增殖、血管生成、細胞增殖與凋亡等多重生物學作用。由此可見，MSC-EVs 中差異microRNAs 可能優先調控上述關鍵通路，參與組織損傷的修復。

本研究篩選出的最重要的4 種microRNAs：hsa-miR-93-5p 調控193 個基因，參與42 個細胞通路；hsa-miR-19b-3p 調控142 個基因，參與51個細胞通路；hsa-miR-23b-3p 調控126 個基因，參與42 個細胞通路；hsa-miR-34a-5p 調控106 個基因，參與42 個細胞通路。RORA 和IQSEC2 是被microRNAs 調控最多的基因，均為7 個，CBL、DPYSL5 和VPS37D 均被6 個microRNAs 調控。細胞黏附、細胞分化、細胞增殖調節、轉運和誘導凋亡是被microRNAs 調控最多的功能。

miR-19 家族在心臟、血管、神經元發育中起重要作用，可作為這些器官疾病的生物標志物和干預的靶點[29]。有研究報道，MSC-EVs 中高表達miR-19b，可通過下調PTEN 的表達，起到抑制神經元的凋亡、調控分化的作用[30]。另有研究報道，下調miR-34a-5p 可促進脂肪MSC 的增殖和遷移，抑制細胞凋亡，從而促進脂肪MSC 對心肌梗死損傷的保護作用，而這一作用可能是通過刺激CTRP9 的表達實現的[31]。miR-149-3p 通過靶向FTO 調節MSC 成脂分化和成骨分化的轉換[32]。暴發性心肌炎患者血漿miR-4763-3p 表達上調，且隨著病情的恢復，其表達水平也逐漸恢復，提示miR-4763-3p 可作為暴發性心肌炎的生物標志物。miR-4763-3p 的預測靶基因主要參與炎癥反應過程，如T、B 細胞受體、腫瘤壞死因子、白細胞跨內皮遷移以及趨化因子信號通路等[33]。這些研究結果支持上述microRNAs 可能參與調控缺氧預處理MSC 的組織修復過程。

綜上所述，本研究用微陣列方法篩選了缺氧預處理MSC-EVs 與其母細胞差異microRNAs 的表達譜，通過生物信息學方法，預測了microRNA-mRNA 調控網絡，提供了缺氧預處理MSC-EVs 組織修復的候選分子及其相關途徑列表，為后續機制和治療靶點的研究提供生物信息學基礎。后續，我們將進一步進行詳細的功能研究，以確認這些候選分子和途徑的功能和作用。