腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中的應用研究

戰曉燕 劉志國 畢天明 馬 靜 張紅巍 薛德林，4?

1 上海農林職業技術學院 上海 201699

2 遼寧威蘭生物技術有限責任公司 沈陽 110033

3 北京春旭生物科技有限公司 北京 100032

4 中國科學院沈陽應用生態研究所 沈陽 110016

腐植酸是一種廣泛存在于自然界中結構復雜、功能活躍的混合物。由于腐植酸具有特殊的分子結構和生物學功能，作為飼料添加劑在水產養殖的淡水、海水中應用已取得很好的使用效果[1～10]。本文對含腐植酸鈉的腐植酸餌料添加劑在蝦池中噴灑，輔助噴灑枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、海洋紅酵母、光合細菌，對南美白對蝦工廠化淡水養殖中的應用效果進行研究，旨在為含腐植酸鈉的腐植酸餌料添加劑和微生物制劑在南美白對蝦的工廠化循環水養殖中的應用提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

（1）枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 2018），從遼寧大連黃海海域底泥中分離得到。

（2）釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CICC 1421），從中國工業微生物保藏管理中心購買。

（3）嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus CICC 6074），從中國工業微生物保藏管理中心購買。

（4）海洋紅酵母（Marine red yeast 2019），從遼寧大連渤海海域海參養殖圈中分離得到。

（5） 光 合 細 菌（Photosynthetic bacteria 2019），從遼寧大連渤海海域海參養殖圈中分離得到。

1.1.2 供試原料

（1）腐植酸鈉，從內蒙古霍林河郭勒樹艷腐植酸公司訂購。水溶性腐植酸含量（干基）≥60%～70%，細度≤80 目，水分≤10%，pH=8.5。

（2）豆粕，黑龍江省九三油脂集團生產，市售。顏色為淺黃色至淺褐色，具有烤大豆香味，成分：蛋白質50%，賴氨酸3.0%，色氨酸0.7%，蛋氨酸0.7%，水分≤10%。

（3）精氨酸菌泥粉，從河北精晶藥業科技股份公司訂購。蛋白質含量≥52%，碳水化合物（糖）含量≥8.0%，總磷含量≥1.0%，灰分含量≤5.0%，水分含量≤8.0%，細度≤100 目。

（4）麥麩皮，黑龍江八五零農場生產，市售。小麥加工的主要副產物。

（5）大米糠，黑龍江八五零農場生產，市售。稻米加工的主要副產物。

（6）啤酒酵母泥，沈陽盛京啤酒有限公司集團生產，市售。啤酒發酵過程中的主要副產物，成分為：蛋白質60%，賴氨酸5.0%，色氨酸1.0%，蛋氨酸0.9%，水分≤50%。

1.1.3 供試設備

發酵罐，鎮江雙瑞生物設備有限公司生產；固體發酵機組，中國水產科學院上海漁用機械研究所研制生產。

1.1.4 供試苗種

南美白對蝦：由廣東海大水產生物科技有限公司繁育，市購。

1.2 腐植酸餌料添加劑產品制備工藝

腐植酸餌料添加劑產品制備工藝：液體發酵菌種→固體發酵物料→烘干粉碎物料→產品保證值檢測。

（1）液體發酵菌種工藝過程：1 支試管斜面→1 瓶1000 mL 三角搖瓶（搖床培養24 h）→1 t種子罐（24 h）→10 t 發酵罐（36 h）。

將選用的枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、海洋紅酵母和光合細菌分別在各自的種子罐、發酵罐中培養，各種菌所選用的發酵培養基、發酵條件及發酵結果見表1。

（2）固體發酵物料工藝過程：2 t 旋轉蒸球高溫高壓處理固體發酵物料（腐植酸鈉、豆粕、麥麩皮、大米糠）→物料冷卻后與發酵菌液（精氨酸菌泥粉、啤酒酵母泥、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌）混合→傳送帶機械鋪料→采用流動履帶式全自動發酵機組發酵。

（3）烘干粉碎物料過程：傳送系統→負壓式低溫真空流化床→傳送系統→大型微粉機械→多級篩過篩→傳送系統→成品包裝→質檢→腐植酸餌料添加劑產品。

（4）產品保證值檢測：粗蛋白檢測按照國家標準GB/T 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法進行測定；小肽檢測按照國家標準GB/T 22492-2008 大豆肽粉中，飼料中酸溶蛋白的測定方法進行測定，小肽分子量小于2000 道爾頓；總酸檢測按照國家標準GB 5413.34-2010 食品安全國家標準 乳和乳制品酸度的測定對飼料中總酸進行測定；氨基酸檢測按照國家標準GB/T 18246-2000 飼料中氨基酸的測定進行測定；揮發性鹽基氮檢測按照國家標準GB/T32141-2015 飼料中揮發性鹽基氮的測定進行測定；含水量檢測按照國家標準GB/T 6435-2014 飼料中水分的測定方法進行檢測。

1.3 試驗設計

1.3.1 南美白對蝦工廠化淡水循環水養殖

（1）試驗養殖池布置。

4 個試驗組和1 個對照組各設置3 個養殖池，共設置15 個養殖池，每個養殖池的水體體積為6.0 m×5.0 m×1.2 m ＝36.0 m3，周邊為圓角，水體總體積540.0 m3，隨機排列，具體試驗設計如表2。

表2 試驗設計Tab.2 The design of experiments

（2）試驗養殖池投餌量及投餌方式。

投餌量：按照且參考南美白對蝦日投餌量表3進行。

表3 南美白對蝦日餌料投喂量參考表Tab.3 Reference table for feeding amount of P. vannamei bait

投餌方式：每天投餌6 次，從早晨6：00 開始，每隔3 h 投喂1 次，到晚上6：00 后隔6 h 投喂1 次。將餌料按照規定投餌量放入到喂料盆中，用手將餌料均勻地投撒在養殖池中的餌料盤中。觀察南美白對蝦的采餌情況、生長情況，并且做好觀察記錄。

（3）試驗養殖池中微生物制劑的投放劑量和投喂方式。

各試驗組和對照組均按照試驗布置的用量，在早晨6：00 首次投餌前，將腐植酸餌料添加劑和微生物制劑均勻地投撒到養殖池中，試驗期內每5 天投灑1 次，共應用12 次，使用量按照表2 進行。對照組投撒同體積同質量水。

投喂餌料：養殖池48 h 前全部投喂鹵蟲幼體，48 h 后開始投喂開口餌料，按照15 克/萬尾的量投喂，此后按前1 天的10%增加餌料量，每天喂6 次。

（4）試驗養殖池水體的處理方式。

養殖試驗池設在內陸省份，距海岸線600 km，需要采用海水逐級淡化養殖模式。

儲水池水質處理：將井水抽到儲水池中，隨之用5 ppm 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）絡合水體中重金屬離子。用海水晶模擬海水，將水體中的鹽度調整到蝦苗所需要的濃度。將調整好的養殖水，沉淀24 h 后通過膜過濾分別流入到試驗池中，池水深0.5 m，放入養殖水后，再一次確定放苗前養殖水的水質指標：鹽度15‰，溶氧量8 mg/L，溫度25 ℃，pH 8.4，當蝦苗生長所要求的指標基本一致時即可放苗。

第一次放苗的密度（標苗期）：廣東海大水產生物科技有限公司仔蝦苗（育苗期為20 天），每一個池子放苗數為：20 萬尾/36 立方米。

第二次放苗的密度（養成期）：蝦苗重量為3000 尾/公斤，大約4 厘米/尾時開始分苗，分完苗后放苗密度為700 尾/立方米，試驗養殖池水體按照36 m3計算，實際放苗密度25200尾/36立方米。

放苗結束后，通氣，投料，投餌量按照南美白對蝦日餌料投喂量參考表投喂進行。

1.3.2 試驗時間、地點、管理

試驗時間：標苗期2018 年10 月1 日—30 日；養成期2018 年11 月1 日—30 日。

試驗地點：河南省新鄉市長垣縣鴻志農業與華大基因組合作水產養殖基地。

日常管理：按照試驗設計投撒腐植酸餌料添加劑和微生物制劑、投餌、換水等項管理措施，按照正常管理進行。

南美白對蝦最適生長溫度為25±1 ℃，最適生長鹽度為15‰，通過逐級稀釋鹽度的方法養殖，可以稀釋到1‰～2‰，且可在淡水中正常生長。

南美白對蝦養殖池水淡化：自投苗的第3 天起，每天上午添加淡水使水位上升10 cm。到加水的第5 天，池水水位加至100 cm，然后每天上午先排池水使水位下降10 cm，接著加淡水使水位上升5 cm，下午再加淡水使水位上升5 cm，仍維持池水當天水位不變，這樣在池水淡化的13 天內，使池水鹽度每天約降低1‰～2‰。當池水鹽度降至3‰時，每天上午排池水20 cm，當天上、下午各加淡水10 cm，始終保持水位不變，待池水鹽度降到0.5‰。營造南美白對蝦適宜的生長條件，每7 ～10 天，根據檢測結果定期補鈣、鎂、鉀和微量元素、多種維生素等。

南美白對蝦循環水池水處理程序：養殖池排出的水進入循環水池，通過向內接入大量的芽孢桿菌、硝化細菌、反硝化細菌、光合細菌等菌株，再通過增加循環水池中的通氣量，對循環水進行處理，使得池中的生物耗氧量和化學耗氧量達到正常的指標。

1.3.3 測定指標及經濟效益計算

蝦苗成活率：表示成活的蝦苗數量占蝦苗總量的百分數，即成活率（%）=成活的數量÷總數量×100。

蝦苗增長率：即蝦苗體長增加率，表示體長增加的長度占體長原長度的百分數，蝦苗體長增加率（%）=體長增加的長度÷體長原長度×100。

餌料系數，即料肉比（FCR），是指飼養的動物增重一單位重量所消耗的飼料的重量。餌料系數（料肉比）=餌料消耗量/增重量×100%。

經濟效益分析：按照經濟效益計算公式，試驗凈效益（產出）=試驗增加收入-試驗投入費用。

試驗增加投入成本：腐植酸餌料添加劑和微生物制劑所投入費用。

1.4 南美白對蝦工廠化淡水養殖中水體理化指標 測定

溶解氧：采用國際標準ISO-5813-1983 水質溶解氧的測定碘量法標準。

pH：使用玻璃電極法進行檢測。

透明度：采用塞氏盤測定方法進行。

濁度：按照國家標準GB/T 13200-91 水質濁度測定進行檢測。

氨態氮：按照國家標準GB/T 5750.5-2006 生活飲用水標準檢驗方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 腐植酸餌料添加劑生產

2.1.1 液體發酵

按表1 選用的培養基、發酵條件，經36 h 發酵，可生產出枯草芽孢桿菌≥2×1010cfu/mL、釀酒酵母≥3×109cfu/mL、嗜酸乳桿菌≥7×109cfu/mL、海洋紅酵母≥3×109cfu/mL、光合細菌≥5×109cfu/mL的菌液。

2.1.2 固體發酵

將腐植酸鈉30 份、豆粕20 份、精氨酸菌粉20 份、麥麩皮10 份、大米糠10 份、啤酒酵母泥10 份，以枯草芽孢桿菌15 份、嗜酸乳桿菌15 份、釀酒酵母菌15 份為發酵菌種，混拌均勻后放入DL-帶式發酵干燥機，經100 h 兼性厭氧—厭氧—好氧發酵，再經流化床低溫干燥，粉碎300 目，得腐植酸餌料添加劑。

2.1.3 腐植酸餌料添加劑的產品保證值

通過腐植酸飼料添加劑產品工藝生產出的腐植酸餌料添加劑產品保證值及與腐植酸的區別見 表4。

表4 腐植酸餌料添加劑產品保證值及與腐植酸的區別Tab.4 The difference of humic acid bait additives products guarantee value and humic acid

2.2 腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦 工廠化淡水養殖中的應用效果

腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中的應用效果，見表5 ～表8。

通過表5、表6 結果可以看出，經過（標苗期）30 天的試驗，結果表明：試驗組1 與對照組相比，南美白對蝦成活率提高4.50%，增長率提高0.33%，日增重提高0.125 kg/36 m3，區組間試驗增重率7.03%，餌料系數降低0.0200；試驗組2 與對照組相比，南美白對蝦成活率提高3.50%，增長率提高0.33%，日增重提高0.101 kg/36 m3，區組間試驗增重率5.68%，餌料系數降低0.0203；試驗組3 與對照組相比，南美白對蝦成活率提高6.50%，增長率提高0.67%，日增重提高0.158 kg/36 m3，區組間試驗增重率提高8.33%，餌料系數降低0.031；試驗組4 與對照組相比，南美白對蝦成活率提高9.00%，增長率提高1.00%，日增重提高0.190 kg/36 m3，區組間試驗增重率10.69%，餌料系數降低0.030。觀察蝦苗的活力、體力、體色和蝦殼質量，4 個試驗組明顯好于對照組。

經方差分析南美白對蝦（標苗期）30 天試驗的平均重量結果：試驗組1 與對照組比較：P=0.0025，P ＜0.01，差異極顯著；試驗組2 與對照組比較：P=0.0039，P ＜0.01，差異極顯著；試驗組3 與對照組比較：P=0.0002，P ＜0.01，差異極顯著；試驗組4 與對照組比較：P=0.0004，P ＜0.01，差異極顯著；試驗組3 與試驗組4 比較：P=0.1170，P ＞0.05，差異不顯著。

表5 腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中成活率與體色、蝦殼質量的影響（標苗期）Tab.5 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on survival rate, body color, shell quality of P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture (the seedling stage)

表6 腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中日增重與餌料系數的影響（標苗期）Tab.6 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on daily weight gain and feed coefficient of P. vannamei in industrial freshwater aquaculture (the seedling stage)

由表7、表8 可知，經過（養成期）30 天的試驗，結果表明：試驗組1 與對照組相比，南美白對蝦成活率提高3.00%，增長率提高0.06%，日增重提高0.676 kg/36 m3，區組間試驗增重率8.35%，餌料系數降低0.064；試驗組2 與對照組相比，南美白對蝦成活率提高2.00%，增長率提高0.06%，日增重提高0.669 kg/36 m3，區組間試驗增重率8.26%，餌料系數降低0.057；試驗組3 與對照組相比，南美白對蝦成活率提高6.00%，增長率提高0.09%，日增重提高0.885 kg/36 m3，區組間試驗增重率10.93%，餌料系數降低0.086；試驗組4 與對照組相比，南美白對蝦成活率提高8.00%，增長率提高0.12%，日增重提高1.138kg/36 m3，區組間試驗增重率14.06%，餌料系數降低0.084。觀察蝦苗的活力、體力、體色和蝦殼質量，4個試驗組明顯好于對照組。

經方差分析南美白對蝦（養成期）30 天試驗的平均重量結果：試驗組1 與對照組比較：P=0.0171，0.01 ＜P ＜0.05，差異顯著；試驗組2與對照組比較：P=0.0183，0.01 ＜P ＜0.05，差異顯著；試驗組3與對照組比較：P=0.0007，P ＜0.01，差異極顯著；試驗組4 與對照組比較：P=0.0001，P ＜0.01，差異極顯著；試驗組1 與試驗組2 比較：P=0.0057，P ＜0.01，差異極顯著。

2.3 腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦 工廠化淡水養殖中理化指標的影響

腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中理化指標影響見表9、表10。

由表9 可以看出，經過標苗期30 天的試驗，結果表明：試驗組與對照組相比，南美白對蝦工廠化淡水養殖水質理化指標均有變化，pH 趨于穩定，透明度和濁度均在可控范圍之內，氨態氮降低0.010 ～0.022 mg/L、亞硝酸鹽降低0.012 ～0.022 mg/L。

經過養成期30天試驗（表10），測定結果表明：試驗組與對照組相比，南美白對蝦工廠化淡水養殖中理化指標均有變化，pH 趨于穩定，透明度和濁度均在可控范圍，氨態氮降低0.001～0.030 mg/L、亞硝酸鹽降低0.016 ～0.026 mg/L。投放腐植酸餌料添加劑、微生物制劑的養殖池，應增加通氣量，使溶解氧更加充分。

經方差分析南美白對蝦（養成期）30 天試驗的氨態氮結果：試驗組1 與對照組比較：P=0.0463，0.01 ＜P ＜0.05，差異顯著；試驗組2與對照組比較：P=0.0474，0.01 ＜P ＜0.05，差異顯著；試驗組3 與對照組比較：P=0.0380，0.01 ＜P ＜0.05，差異顯著；試驗組4 與對照組比較：P=0.0205，0.01 ＜P ＜0.05，差異顯著。

2.4 腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中經濟效益的分析

腐植酸餌料添加劑、微生物制劑對南美白對蝦工廠化淡水養殖中經濟效益的分析見表11。

由表11 可以看出，試驗組1 投入成本增加172.8 元/36 立方米，增加收入810.8 元/36 立方米，增加產出638.0 元/36 立方米；試驗組2 投入成本增加172.8 元/36 立方米，增加收入802.0 元/36 立方米，增加產出629.2 元/36 立方米；試驗組3 投入成本增加345.6 元/36 立方米，增加收入1054.1元/36 立方米，增加產出708.5 元/36 立方米；試驗組4 投入成本增加518.4 元/36 立方米，增加收入1365.6元/36立方米，增加產出847.2元/36立方米。

表7 腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中中成活率與體色、蝦殼質量的影響（養成期）Tab.7 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on survival rate, body color, shell quality of P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture (the development stage)

表8 腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中日增重與餌料系數的影響（養成期）Tab.8 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on daily weight gain and feed coefficient of P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture (the development stage)

表9 腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中水體理化指標的影響（標苗期）Tab.9 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on physical and chemical indicators of water body in P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture (the seedling stage)

表10 腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中水體理化指標的影響（養成期）Tab.10 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on physical and chemical indicators of water body in P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture (the development stage)

表11 腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中的經濟效益分析Tab.11 The analysis of humic acid bait additives and microbial preparations on economic benefit of P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture

3 結論與討論

（1）以單獨使用腐植酸餌料添加劑，不同使用量腐植酸添加劑（0、5、10 mg/m3）和微生物制劑（枯草芽孢桿菌1 mg/m3、嗜酸乳桿菌1 mg/m3、海洋紅酵母1 mg/m3、光合細菌2 mg/m3）配施為4 個試驗組，以不使用腐植酸餌料添加劑和微生物制劑為對照組。經過標苗期30 天試驗，結果表明：試驗組與對照組相比，南美白對蝦成活率提高3.50%～9.00%，增長率提高0.33%～1.00%，日增重提高0.125 ～0.190 kg/36 m3，區組間試驗增重率5.68%～10.69%，餌料系數降低0.020 ～0.030。經過養成期30 天的試驗，結果表明：試驗組與對照組相比，南美白對蝦成活率提高2.00%～8.00%，增長率提高0.06%～0.12%，日增重提高0.669 ～1.138 kg/36 m3，區組間試驗增重率8.26%～14.06%，餌料系數降低0.057～0.086。

（2）腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中應用，可使養殖水體的pH 趨于穩定，氨態氮降低0.001 ～0.030 mg/L、亞硝酸鹽降低0.016 ～0.026 mg/L，蝦的體色和蝦殼質量俱佳。經過標苗期30 天和養成期30 天的試驗，養殖重量可達到285.97 kg/36 m3，成活率降低至88.0%，餌料系數達1.368。試驗增加產出最多847.2 元/36 立方米，從經濟效益分析，以腐植酸添加劑10 mg/m3和微生物制劑配施增加產出最佳。

（3）腐植酸餌料添加劑、微生物制劑在南美白對蝦工廠化淡水養殖中應用，可以為南美白對蝦的養殖提供小肽、氨基酸和蛋白質營養，可以降低養殖水體中的銨態氮、硝態氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有毒有害物質的濃度，有效地清除池底積累的殘余餌料和排泄廢棄物，促進單細胞微藻的生長，調節藻菌相，降低透明度，抑制光合作用，從而控制多細胞大型藻類的生長，結合枯草芽孢桿菌產生的蛋白酶等復合酶系，可以起到控草作用，使養殖水體形成一個良性生態循環體系[11，12]。

綜上所述，腐植酸餌料添加劑，作為綠色環保型生物飼料添加劑使用方便、無毒無負作用，在南美白對蝦工廠化淡水養殖中的大面積應用潛力巨大，可在遠離海岸線的內陸地區養殖，可利用蔬菜大棚、畜牧養殖大棚經過簡單修整進行養殖，將腐植酸餌料添加劑與微生物制劑配合使用具有很好的環保效益和社會效益，應用前景廣闊。

致謝：青島理工大學2018 屆碩士研究生喬鳳祿提供水質分析數據，河南省新鄉市長垣縣鴻志農業與華大基因水產養殖基地余英華工程師提供部分養殖數據，在此一并表示感謝。