酒精性肝病患者肝臟鐵沉積研究進展

劉瑩瑩 王曉凡 叢敏

酒精性肝病(ALD)是指因長期大量飲酒導致的肝臟疾病，患者初期表現為單純的肝臟脂肪變性，隨后可進一步進展為肝纖維化，最終導致肝硬化[1]。近年來，飲酒所導致的肝硬化在所有肝硬化病因中所占比例呈現上升趨勢，ALD已經成為我國最主要的慢性肝病之一[2]。而在歐盟國家，所有肝病導致的死亡中，有41%歸因于酒精性肝病[3]。除酒精性肝病外，許多慢性肝臟疾病(CLDs)，如血色病、病毒性肝炎(乙肝和丙肝病毒感染)和非酒精性脂肪性肝病等在肝臟纖維化進展期均會出現鐵水平的升高，尤其是在遺傳性血色病患者當中，發生肝纖維化和肝硬化患者的肝臟鐵含量比無纖維化患者的肝臟鐵含量明顯升高，提示鐵過載可能是導致疾病進展以及加重肝臟病理表現的重要因素[4-5]。

一、鐵的生物學功能

鐵是幾乎所有生物所必須的微量元素。含鐵蛋白除起到運輸和儲存鐵的作用外，也可攜帶或儲存氧并參與催化氧化還原反應，除此之外，鐵也可參與核酸復制、宿主防御和信號轉導[6-7]。然而，當過量的游離鐵存在時可與活性氧(ROS)結合通過芬頓反應催化自由基的產生，從而破壞DNA、蛋白質和脂質，導致嚴重的細胞和組織損傷，進而誘導實質細胞和非實質細胞內促纖維化信號，加速疾病進展從而導致肝纖維化[1，4，7]。因此維持人體內鐵的平衡至關重要。人體僅通過腸上皮細胞的脫落和失血每天排出1～2 mg鐵，而無法通過其他生理途徑的調控排出體內多余的鐵，因此人體對體內鐵含量的調控主要是通過對鐵吸收調控而實現的[4，6-7]。食物中大部分的鐵可以三種不同形式通過十二指腸被人體吸收，即無機非血紅素結合鐵、血紅素結合鐵和鐵蛋白結合鐵，其中最主要的吸收形式是無機非血紅素結合鐵。無機非血紅素結合的Fe3+被十二指腸細胞色素B還原酶還原為Fe2+后，通過位于腸細胞頂端的DMT1進入腸細胞。進入胞質中的Fe2+與伴侶蛋白結合后,被轉運至小腸細胞基底部通過FPN運出細胞，Fe2+經FPN轉運至門靜脈后被氧化為Fe3+，然后與血漿中的轉鐵蛋白結合后進行運輸[8]。80%轉鐵蛋白結合鐵直接到達骨髓，通過轉鐵蛋白受體1(TFR1)進入有核紅細胞，剩余20%進入不同的髓外細胞參與多種代謝過程[9]。

二、人體內鐵穩態的調節

肝臟在人體鐵穩態中發揮著關鍵作用，在正常生理條件下，系統性鐵平衡是由肝臟肝細胞合成和分泌的鐵調素介導的[6，7]。FPN是目前哺乳動物體內已知的唯一的鐵輸出蛋白，主要表達于十二指腸上皮細胞、網狀內皮巨噬細胞、肝細胞和胎盤合體滋養細胞的基底側。鐵調素與FPN細胞外結構結合，觸發胞內區域賴氨酸殘基泛素化，最終使其在溶酶體內內化和降解[10]。當紅細胞生成需要較多的鐵時，鐵調素的合成受到抑制，因此較多的鐵可通過腸細胞和巨噬細胞上的FPN進入血液循環，相反當體內鐵超載時如病原體增殖或炎癥，可誘導鐵調素的表達增加，FPN內化降解，因此進入血液循環的鐵下降[11]。除此之外，細胞內鐵的調節也對人體系統性鐵穩態產生重要影響，其中最重要的是鐵反應元件(IRE)-鐵調節蛋白(IRP1和IRP2)系統。IRPs可以與多種編碼鐵代謝相關蛋白的mRNAs的非翻譯區域(UTRs)內IRE結合。當細胞內鐵的濃度較低時，一方面IRPs與鐵蛋白mRNA的5’-UTR結合抑制其翻譯，從而生成少量的鐵蛋白；另一方面，IRPs與TFR1 mRNA的3’-UTR區域內的IRE結合增加其穩定性，保證其不被降解因而通過其轉運入細胞的鐵增加。而當細胞內的鐵濃度較高時，則產生相反的效應[12-13]。

三、不同因素對鐵調速表達的調控

鐵調素作為人體內重要的鐵調控因子，其表達受到多種因素的調節。目前已知的對鐵調素的調控主要發生在轉錄水平[6，14]，其中包括人體內鐵的狀態、炎癥和紅細胞生成等。血清鐵水平/轉鐵蛋白飽和度和肝臟內鐵含量都會影響鐵調素的表達[6]。當血漿中的轉鐵蛋白飽和度增加時，其使HFE基因編碼蛋白與轉鐵蛋白受體2(TFR2)的相互作用增加，并與鐵調素調節蛋白hemojuvelin(HJV)形成復合物，進一步穩定骨形態發生蛋白(BMP)Ⅰ型受體ALK3，激活BMP/SMAD信號通路；也可活化細胞外信號調節激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，進而促進鐵調素的表達。但是也有研究表明ERK/MAPK通路活化后可通過調節furin蛋白的表達而抑制鐵調素的表達[7，15-16]。除血清鐵水平/轉鐵蛋白飽和度影響鐵調素表達之外，肝臟內鐵含量也會影響鐵調素的表達。當肝竇內皮細胞內的鐵濃度增加時，可通過ROS激活核因子NF-E2相關因子進而通過轉錄調節BMP6的生成，活化BMP/SMAD信號通路促進鐵調素的轉錄[7，16]。HJV是活化BMP受體重要的協同受體，其可通過與SMAD結合而促進鐵調素的表達[10]。HJV的表達受到多種因素的調節，如第一個發現的肝臟鐵調素表達的負性調控因子跨膜絲氨酸蛋白酶/基質酶-2(TMPRSS6)可通過裂解和滅活HJV而作為BMP/SMAD信號通路的負性調控因子，同時也可抑制鐵調素啟動子的活性[10，17]。體內研究發現，TMPRSS6也可不依賴于HJV而抑制HJV敲除小鼠鐵調素的表達，同時在體外研究中證實，TMPRSS6可裂解鐵代謝相關蛋白HFE和TFR2等[7]。除此之外，furin蛋白可水解HJV生成可溶性HJV(sHJV)，sHJV可與BMP2、BMP4和BMP6結合，競爭性抑制HJV與BMP的結合，進而抑制BMP/SMAD信號通路[6]。

炎癥是除人體內鐵狀態外另一種調節鐵調素表達的重要因素。白細胞介素-6(IL-6)與其受體結合后可活化信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)，磷酸化后的STAT3與鐵調素啟動子中的STAT3反應元件結合上調鐵調素的表達[7]。也有研究表明，炎癥除了活化IL-6/STAT3信號通路外，也可刺激BMP/轉化生長因子β超家族配體激活素B與BMP I型受體結合進而活化BMP/SMAD信號通路，并且IL-6/STAT3和BMP/SMAD信號通路之間存在相互作用[7，18]。

紅細胞生成也與人體內鐵水平密切相關，因此也會影響鐵調素的水平。其中由促紅細胞生成素(EPO)誘導分泌的erythroferrone(ERFE)可能是抑制鐵調素表達的因子，其抑制鐵調素表達的過程需要SMAD蛋白的參與，并且不依賴于BMP6、HJV和TMPRSS6[7]。

四、酒精性肝病(ALD)患者肝臟鐵沉積機制

除原發性血色病外，各種CLDs也會出現鐵調節障礙。ALD患者中血清鐵蛋白水平和轉鐵蛋白飽和度升高的比例分別為63%和29%，11%～52% ALD患者出現肝臟鐵含量的增加，并且與健康對照組相比具有統計學差異[10]。早期輕度ALD患者肝臟鐵主要沉積于肝細胞，而晚期重度ALD患者肝臟鐵主要沉積于網狀內皮組織[19]。肝臟鐵的存在被認為是影響ALD患者生存的一個獨立危險因素，是肝纖維化相關因素之一，并且可預測酒精性肝硬化患者肝細胞肝癌甚至死亡的發生[1，10]。既然肝臟鐵含量對疾病的進展會產生很大影響，那么了解ALD患者肝臟鐵沉積機制十分必要。

(一) 鐵調素表達的降低 許多ALD鐵過載患者都會出現血清鐵調素的表達量降低[10]，在ALD患者中鐵調素水平的降低通常伴隨著巨噬細胞中的鐵沉積，酒精介導的肝內鐵調素合成的下調可能是ALD患者肝臟鐵過載主要的潛在的機制之一[19，20]。

1、 基因突變：在一項meta分析中發現，HFE基因H63D位點純合突變與患ALD的易感性相關[17，21]，并且HFE單一位點突變會使ALD患者發生肝臟鐵沉積的風險增加[22]。與無肝鐵蓄積的ALD患者相比，HFE突變在出現肝鐵沉積的ALD患者中更常見，但HFE突變與肝纖維化、疾病嚴重程度或炎癥活動度的增加無關。然而也有研究表明無論是HFE基因的C282Y還是H63D雜合突變都不會增加ALD患者鐵沉積的風險[10，23]。這可能與兩項研究的人群不同有關。

2、 生長因子表達增高：表皮生長因子(EGF)和肝細胞生長因子(HGF)是肝臟損傷后肝細胞修復和再生的重要介質。EGF和HGF以及其他生長因子，可能通過抑制鐵調素的合成，促進肝臟中鐵蓄積，進而加速肝臟疾病的進程[10，24]。體外研究表明，EGF可通過減少SMAD1/5/8的核定位來抑制鐵調素的表達。HGF對鐵調素的調節發生在轉錄水平，可通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路和MAPK/ERK通路干擾SMAD的核定位、增加SMAD轉錄抑制物質TG-相互作用因子、抑制鐵調素啟動子活性進而抑制鐵調素的表達[24]。

3、 應激反應：酒精誘導的肝細胞氧化應激是其抑制肝細胞鐵調素表達下降的主要機制之一[17]。酒精代謝過程中可通過增加細胞色素P450 2E1的活性和破壞線粒體的抗氧化反應兩種方式增加ROS的生成[10]。除此之外，酒精也可能通過增加血液循環中脂多糖(LPS)水平，誘導巨噬細胞促炎性細胞因子尤其是腫瘤壞死因子α(TNFα)和ROS的釋放。氧化應激可以增加TMPRSS6、sHJV和HGF等的表達進而抑制鐵調素的表達[10]，也會抑制鐵調素啟動子的活性和轉錄調節因子C/EBPα的活性進而抑制鐵調素的表達[14，17]。盡管如此，目前關于ROS對鐵調素調節的研究仍然存在爭議。H2O2作為一種最主要的ROS，當其濃度在0.3～6 μM之間時會通過增加STAT3的磷酸化促進鐵調素啟動子的活性，而當H2O2的濃度大于50μM時又會抑制鐵調素的表達[25]。除氧化應激外，內質網應激也會導致肝臟鐵過載。在酒精和高脂飲食誘導的肝損傷小鼠模型中，肝臟鐵過載會誘導發生內質網應激反應[10]，而在內質網應激的早期階段，C/EBP同源蛋白表達增加，作為C/EBPα的抑制劑，可顯著抑制鐵調素的表達[26-27]。

4、 低氧：酒精可能通過增加肝代謝活性和改變肝血流量來降低肝內的氧張力[10]。體內研究表明，酒精處理組小鼠與對照組小鼠相比可發生較強的低氧反應，且這種低氧反應與鐵調素的表達抑制相關[20]。研究發現，低氧時發生改變的基因主要受低氧誘導因子(HIF)調控。HIF由HIFα和HIFβ組成，低氧發生時，HIFα首先在細胞漿積聚，隨后易位進入細胞核與HIFβ結合形成二聚體復合物，并進一步結合至許多參與低氧反應基因的啟動子，如TFR1、DMT1和FPN等，促進其轉錄[20，28]，進而增加人體鐵的吸收。而低氧除了通過誘導HIF增加人體鐵吸收外，也會通過調控EPO的生成間接抑制鐵調素的表達[29]。同時HIF也會通過調節EPO生成，進而誘導紅細胞生成ERFE而間接抑制鐵調素的表達[7]。但也有研究表明在低氧情況下鐵調素水平的改變與血清EPO水平無關[14]。除此之外HIF也可介導轉錄調節因子CCAAT/增強子綁定蛋白α(C/EBPα)降解進而抑制鐵調素的表達，而C/EBPα的過表達以及抑制肝臟HIF功能時則可逆轉酒精對鐵調素的抑制作用[20]。低氧環境下，ROS的顯著升高可進而抑制C/EBPα以及STAT3與鐵調素啟動子的結合[30]。此外，在低氧情況下，血清中的血小板源性生長因子(PDGF)-BB升高，PDGF-BB可通過下調轉錄調節因子環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB)和CREB-H的表達，抑制生理性和BMP6誘導性鐵調素的表達[7，14]。

5、 肝臟鐵水平下降：在研究酒精對鐵代謝影響的體內實驗中發現，酒精會使肝臟鐵含量和鐵蛋白的表達顯著下降，因此酒精誘導鐵調素水平下降可能通過鐵水平降低而實現[31]。低鐵飲食或者細胞內較低水平的鐵會抑制TMPRSS6的降解，同時也會通過furin蛋白裂解HJV，增加sHJV的產生，以上均會抑制鐵調素的產生[7]。除此之外，DMT1轉錄后mRNA的穩定性受IRE-IRPs系統的調控，肝細胞內鐵水平下降時，IRPs和IRE結合穩定DMT1的轉錄進而使其表達水平上調，因此鐵吸收增加[8]。

6、 其他可抑制鐵調素表達的因素：酒精的攝入可能會干擾炎癥對鐵調素的刺激而起到抑制鐵調素表達的作用[19]。如體外實驗表明，酒精并不改變鐵調素水平，但是可顯著抑制IL-6對鐵調素的誘導作用[32]。除此之外，酒精也可抑制BMP受體和SMAD1、5的活化，以及SMAD4與鐵調素啟動子的結合從而抑制鐵調素的表達[33]。慢性酒精攝入增加ALD患者門靜脈中腸源性內毒素LPS的水平，LPS與Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)4結合后可活化核因子(NF)-κB。體內實驗研究表明，酒精可抑制野生型小鼠鐵調素的表達而不能抑制TLR4突變型小鼠，并且不發生NF-κB p65亞基的磷酸化和核易位，因此酒精可通過TLR4信號通路發揮對鐵調素的抑制作用[34]。

(二) 其他導致鐵沉積的機制 鐵吸收的增加是除鐵調素外導致ALD患者肝臟鐵過載的另一重要因素。除上文所提到的低氧和肝鐵水平降低可導致鐵吸收增加外，腸道通透性的改變以及葡萄酒中所含的鐵同樣被認為是促進腸道鐵吸收的潛在機制。酒精可增加腸道的通透性，使鐵和內毒素通過腸道進入人體循環增加[17]。有文獻報道酒精代謝產物乙醛可能通過增加IRP的活性而增加肝細胞TFR1的表達，TFR1表達增加后肝細胞攝取轉鐵蛋白結合鐵增加[35]。同時酒精也會誘導庫普弗細胞內轉錄因子NF-κB的活化、炎癥因子TNF-α等的釋放，炎性因子又會增加庫普弗細胞鐵的攝取由此形成正反饋調節[17，35]。

五、展望

ALD已成為我國最主要的肝病之一，其在同期肝病住院患者中的比例不斷上升，酒精性肝硬化占肝硬化病因的構成比也在逐年上升。約有50%的ALD患者出現肝臟鐵沉積。酒精介導的鐵調素的表達下調，肝細胞中TFR1表達的上調，以及同時伴隨的十二指腸DMT1和FPN表達的增加，均導致了ALD患者的系統性鐵沉積?，F有研究表明，鐵調素表達的降低是ALD患者鐵沉積的主要原因，鐵沉積物和非轉鐵蛋白結合鐵通過刺激肝細胞的氧化應激而進一步損傷肝臟。因此，深入研究酒精肝患者鐵沉積機制尤其是鐵調素相關機制有利于對該疾病提供新的臨床診斷和治療依據。未來對于ALD的研究，更應該側重于鐵調素激動劑、人工合成鐵調素，以及通過干預各種代謝途徑以刺激內源性鐵調素合成等方向。