高通量測序與遺傳代謝疾病的研究進展

孫松陽 綜述 汪希珂 審校

(1.貴州大學，貴州 貴陽 550000；2．貴州省人民醫院兒內科，貴州 貴陽 550002)

高通量測序技術的應用已有近50年的歷史，在遺傳代謝性疾病的診斷分析，確定相關的致病基因，發現新的治療策略等方面起到了巨大的作用。尤其是21世紀以來，高通量測序技術在速度，讀取長度，數據吞吐量方面取得了長足的發展，每堿基的測序成本也急劇下降，為在基礎科學以及轉化研究領域中大量新型測序技術的應用和開發鋪平了道路。在此，本文概述了高通量測序技術的發展，介紹了高通量測序技術的優點與不足，探討了高通量測序技術當前的應用狀況，并展望未來的發展。

1 高通量測序技術

1.1簡介 高通量測序技術又名第二代測序(NGS)技術，特點是能一次對并行的幾十萬到幾百萬條DNA分子進行測序和高精度短讀等。使用NGS，可以在一天內對整個人類基因組進行測序，NGS徹底改變了基因組研究。相比之下，以前用于破譯人類基因組的桑格測序技術需要十多年才能完成最終人類基因組草圖[1]。NGS包括整個外顯子組測序(WES)和全基因組測序(WGS)。NGS的應用包括RNA測序、ChIP-seq、ChIP芯片、全基因組測序、全基因組結構變異、突變檢測和載體篩選、遺傳性疾病的確定、DNA文庫的制備、線粒體基因組測序和個體基因組學等。NGS在獲取有關遺傳、表觀遺傳調控網絡，染色質結構，核結構和基因組變異的信息方面也有很大的貢獻。人類基因組外顯子(編碼序列)測序被稱為全外顯子組測序(WES)，測序期間，每個堿基都被多次測序，以提供高度準確的數據。隨后，利用生物信息學分析，精確定位人類參考基因組的個體讀數來得到統一的片段[1]。WES可以幫助確定與特定病癥相關的致病基因，發現新的治療策略。通過WES解決的第一個單基因疾病是2009年的多發畸形障礙米勒綜合征[2]。因為超過80%的致病變異位于包含人類基因組編碼區的外顯子中或附近[3]，這些編碼區的堿基對突變最有可能會引起嚴重的直接病變表型，所以涵蓋所有已知外顯子及其側翼區域的WES已經成為對遺傳代謝病進行診斷分析的首選方法。隨著新的軟件和方法的迅速發展，WES成本更低且更有效，WES技術可以更好地檢測復雜的遺傳變化。WES與醫療保健的整合已經在進行中，在臨床的診斷、疾病預后、治療決策等方面，WES都扮演著不可或缺的角色。WGS是確定生物體基因組完整核苷酸序列的過程，通過對從頭組裝或映射到高質量參考基因組的片段進行“鳥槍”測序來實現[4]。普遍認為WGS是比WES更為強大的工具，可捕獲幾乎所有已知的遺傳變異。

1.2測序技術的發展 在20世紀70年代，F.Sanger等[5]和A.M.Maxam等[6]分別開發了DNA測序的方法。F.Sanger及其同事開發的技術，通常稱為Sanger測序，與A.M.Maxam的方法相比，有毒化學品和放射性同位素處理更少。最后，Sanger測序成為未來30年流行的DNA測序方法，Sanger測序也被稱為第一代技術。在1977年至2005年期間，對高通量、低成本的測序需求推動了大規模并行技術的發展，第二代測序技術NGS應運而生。相對于NGS，Sanger測序昂貴且耗時，NGS可以同時對數百萬乃至數十億個DNA同時進行測序[7]，極大地降低了成本，提高了測序的產量。454生命科學公司推出的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統：羅氏454測序系統，開創了第二代測序技術的先河。該技術是通過合成反應而測序(SBS)的原理進行測序的。2005年以來，大規模平行測序(MPS)平臺已經廣泛應用。相對于Sanger測序，MPS將DNA測序的成本降低了幾個數量級[8]。2001年，人類基因組計劃使用第一代Sanger測序技術對人類基因組進行測序，需要13年和27億美元[9]。2014年，Illumina發布了HiSeq X系統，該系統運行3天產生的的數據相當于16個人類基因組。每個人類基因組按照30倍覆蓋率的金標準進行測序，成本略高于1000美元[10]。Illumina，Solex，SOLID的第三代測序技術能確定單個DNA分子的堿基組成，還能夠實時排序，包括單分子熒光測序技術和納米孔測序技術。以納米孔測序為例，它基于DNA分子通過納米孔，可以對單個分子進行實時測序。主要特點是直接測序DNA或DNA，不需要文庫制備或測序試劑的RNA分子；可以進行長閱讀，但是精度偏低[11]。

1.3高通量測序的步驟 WES的步驟包括人類基因組中所有外顯子的捕獲，測序和分析人類基因組中所有蛋白質編碼基因的所有外顯子。首先將整個基因組分成小片段，然后將這些小片段的脫氧核糖核酸連接到特殊的銜接子上，或者讓片段通過微小的通道，在通道中確定每個片段的序列。在二代測序中，來自整個基因組的數百萬個這樣的基因片段被同時測序。二代測序設備采用這種MPS技術來產生序列數據。所研究區域的每個核苷酸將被包含在多次讀數中，反復分析。然后，數百萬次分析的讀數序列被重新組裝，或者與人類基因組進行比較[12]。在NGS中，測序是通過重復循環由聚合酶介導的核苷酸延伸來完成的。NGS是一個大規模的并行過程，根據平臺的不同，產生數百兆到千兆位的核苷酸序列，可以有針對性的增加感興趣區域序列覆蓋率，成本更低，吞吐量更高。大多數大規模靶向測序方法都使用混合選擇方法選擇出變體，與WGS相比，WES平臺具有更少的原始序列和更低的成本。例如，需要90 Gb的序列才能獲得30倍的基因組平均覆蓋率，而使用當前最先進的靶向平臺，只需要3 Gb序列的外顯子組就可以獲得75倍的平均覆蓋率[13]。

1.4下一代測序的不足 外顯子組富集是WES的基礎，富集方法包括雜交捕獲或基于溶液的方法富集[14]。與Sanger測序不同的是，樣本的每次運行都生成一個測序讀數，每次讀取的特定位置必須通過計算確定，稱為映射或對齊。其次，需要多重覆蓋來分析樣品的完整等位基因含量[15]，這一過程中存在效率低下的問題。例如，不同外顯子間不平衡的捕獲效率可能導致外顯子序列覆蓋率低；目標外雜交意味著至少20%的讀數序列來自外顯子組外的基因組DNA，而且外顯子組捕獲也沒有完成。序列捕獲方法中的探針是基于基因注釋數據庫(如CCDS數據庫和RefSeq數據庫)中的信息設計的，未知或尚未注釋的外顯子、進化保守的非編碼區域和調控序列(如增強子或啟動子)通常不會被捕獲。WES的片段測序的測序錯誤率比Sanger測序更高，但在一定程度上可以通過增加測序覆蓋的深度來糾正。因此，使用Sanger測序進一步驗證已鑒定的變異非常重要[16]，但這也增加了成本。隨著測序和捕獲技術的不斷改進，這些效率問題都有可能得到解決。外顯子組的高覆蓋率可以使大量樣本測序變得經濟實惠，更有利于發現突變。由于序列結構的性質，WES在某些基因組區域分析中也存在局限性。WES無法檢測某些類型的基因組變異，包括插入/缺失，拷貝數變異，重復擴增，深度內含子變異和線粒體基因組變異[17]。WES還可能遺漏某些導致疾病的遺傳變異，這可能是由于含有變體的基因組區域捕獲不良引起的，WES只覆蓋外顯子及其側翼區域，不能檢測內含子和非編碼調控區域以外的致病變異。結構基因組變異，大型插入、缺失、重復，拷貝數變異，變異線粒體基因組均不能探測到。由于技術的性質，使用錯誤的過濾器或不適當的過濾器用于分析數據將導致錯誤的診斷[18]。總之，為了使WES適合臨床診斷，面臨的技術挑戰包括改進外顯子捕獲，測序覆蓋率，讀取長度，準確檢測插入缺失以及減少假陽性和假陰性率等[19]。在臨床應用WES的另一個挑戰是在眾多臨床意義不確定的變異中識別臨床相關的變異。此外，現有數據庫中超過25%的致病變異是不正確的，這使得解釋測序結果變得非常困難[20]。在許多情況下，準確的臨床病史和生化檢測信息是必不可少的，以避免對WES所得結果的誤讀。由于對候選基因的功能缺乏足夠的認識，無法做出明確的診斷，在這種情況下，可能需要廣泛的功能研究來證明候選基因和變異與患者臨床表型之間的因果關系。WGS覆蓋了整個人類基因組的98%，WES與WGS相比，覆蓋了95%的編碼區域，但僅占基因組的1%～2%。WES的單樣本成本更低，目標區域的覆蓋深度更大，存儲需求更少，并且數據分析更易于執行。2018年A.Alfares等[21]比較WES和WGS在臨床上的檢出率，對WES的數據重新分析后發現WGS的檢出率僅高7%。同時，每個WES成本約為1 200美元，WES重分析成本約為250美元，每個WGS的費用約為4200美元。所以，盡管WGS比WES更強大，覆蓋的更均勻，但是臨床效用有限，且成本更高。

2 遺傳代謝疾病

2.1遺傳代謝疾病定義 遺傳代謝病(IMD)是因維持機體正常生化代謝途徑中的酶、輔酶或載體蛋白缺陷或異常及膜泵生物合成發生遺傳缺陷，即編碼這類多肽(蛋白)的基因發生突變，導致產物缺乏或底物堆積，從而引起相應臨床癥狀的一組疾病。

2.2遺傳疾病分類 遺傳疾病分為染色體疾病和單基因疾病，有學者[22]認為染色體疾病是由人類發育早期植入的異常染色體重排引起的，已經發現了大約7000種不同的單基因疾病。染色體疾病包括染色體結構變異，數目變異等，如18-三體、21-三體等；遺傳代謝病多為單基因遺傳病，包括代謝大分子類疾病：溶酶體貯積癥、線粒體病等，代謝小分子類疾病：氨基酸、有機酸、脂肪酸等。遺傳代謝病部分病因是基因遺傳，還有一部分是后天基因突變造成，發病時間覆蓋全年齡階段，受累人數約占全球總人口的1%[23]。綜合所有染色體和單基因疾病的發病率，與諸如癌癥等更復雜的遺傳疾病相比，遺傳疾病被認為是相對罕見的，但是作為世界上人口最多的國家，中國的罕見遺傳病患者數量眾多，大約有1000萬患有遺傳代謝疾病的患者生活在14億人口中[24]。

2.3高通量測序的應用

2.3.1高通量測序技術在產前診斷中的應用 通過產前診斷，父母可以選擇終止受影響的妊娠，在醫院，母親血清篩查和胎兒超聲檢測可用于幫助檢測胎兒是否患有染色體疾病。基于高分辨率陣列的染色體分析方法已經可用于檢測染色體疾病，通過羊膜穿刺術和胎兒核型分析來確認陽性結果[25]。但是，性染色體疾病不能通過母體血清篩查檢測到，并且通常在超聲檢查中沒有任何明顯的臨床癥狀。由于大多數夫婦在懷孕前都不知道自己的攜帶者身份，所以預防單基因疾病在很大程度上是無效的。此外，由于識別致病突變所需的成本和時間，絕大多數具有遺傳疾病家族史且因此具有高風險的夫婦沒有進行過基因檢測，中國50%的人口生活在農村地區，沒有接受過良好的遺傳咨詢服務，即使有更多的患者參加檢測，目前的實驗室基礎設施，人員專業知識和公共醫院診斷實驗室的設備也不能充分滿足患者的需要。NGS技術的出現，為中國的遺傳代謝疾病預防提供了新的希望。如無創產前檢測(NIPT)表現出非常高的靈敏度和特異性，可用于檢測常見的非整倍體，如21-三體、18-三體、13-三體以及性染色體[26]。對于高遺傳風險的夫婦，可以對胎兒進行傳統的侵入性分子檢測，這在大多數診斷實驗室中廣泛可用；這些夫婦也可以選擇輔助生殖和植入前遺傳學診斷(PGD)來選擇正常胚胎進行移植。在政府的支持下，NIPT在中國得到推廣，極大的有利于預防和減少患有染色體疾病嬰兒的出生[27]。中國目前的臨床研究活動主要集中在開發用于檢測全譜染色體疾病綜合征的新型NIPT策略，基于NGS的NIPT方法可以同時檢測常見的非整倍體以及亞顯微的缺失和重復。在臨床層面，一些省份正在進行試點研究，以評估這些新方法的可靠性和準確性。此外，基于單倍型的母體血漿靶向測序已被證明對于HHL和SMA的診斷是準確的，另一種稱為循環單分子擴增和重新測序技術(cSMART)的NIPT方法可以準確地對患有Wilson病風險的胎兒進行胎兒基因分型。隨著時間的推移，通過臨床實施第二代NIPT檢測，可以大幅減輕中國遺傳代謝疾病的負擔。

2.3.2高通量測序技術在重大疫情中的應用 2013年的甲型流感H7N9病毒導致數十人死亡。我國科學家對第1例H7N9患者工作的活禽市場臨近攤位的雞籠和二級活禽批發市場進行了取樣，進行全基因組測序，結果表明新型H7N9病毒最有可能從二級批發市場傳播到零售活禽市場，然后傳播到患者身上，明確了傳播擴散途徑，有利于幫助控制人類感染[28]。在病毒的耐藥性突變、溯源和特異性單抗篩選等方面都取得了國際領先的成果。

2.3.3高通量測序技術在地中海貧血中的應用 地中海貧血普遍存在于中國南方，在1993年1月至2003年12月期間，廣州市某中心實施了一項以醫院為基礎的預防計劃，篩查α和β地中海貧血的攜帶者，減少受影響胎兒的出生率。政府制定特殊教育計劃，使公眾意識到受地中海貧血影響胎兒出生率存在，這使得地中海貧血篩查計劃的接受率非常高。地中海貧血患者的出生率大幅下降[29]。

2.3.4高通量測序技術在在遺傳性耳聾研究中的應用 耳聾是一種常見的嚴重出生缺陷，2017年，王翠翠等[30]總結了近5年高通量測序技術和目標區域測序在遺傳性耳聾致病基因研究及臨床分子診斷中的應用以及研究進展，自2010年開始，應用WES已成功鑒定了30個非綜合征性耳聾(NSHL)基因新致病基因，約占已知NSHL致病基因的1/3；同時應用WES至少發現了43個綜合征性耳聾(SHL)或伴有耳聾的復雜性疾病的致病基因，充分說明了高通量測序技術為人類對遺傳性耳聾深入了解發揮了巨大的作用。

3 結語與展望

高通量測序技術可用于鑒定新基因和新疾病，以及定義新表型或擴大已知有害基因變異導致的表型譜，是一種有效的研究工具。隨著測序成本不可避免地下降，越來越多的患者將會選擇高通量測序技術來了解遺傳代謝疾病，減少患兒的出生，為社會和家庭減少負擔。而遺傳咨詢也將成為常規護理中一個必要和重要的組成部分，醫生將結合病史、家族史和基因組數據來識別高風險的變異，向患者解釋患病的原因及風險。隨著高通量測序技術成為醫學實踐的標準組成部分，向公眾宣傳這項技術并讓公眾參與使用這項技術將是非常重要的。高通量測序技術的發展也為臨床診斷和個性化疾病風險分析奠定了基礎。