脫細胞基質對干細胞生物行為的影響

羅應坤 綜述 張霓霓 黃桂林 審校

(遵義醫科大學附屬口腔醫院,貴州 遵義 563006)

1 簡 介

脫細胞組織被廣泛應用于臨床組織修復和再生。一些組織如皮膚、小腸黏膜下層、膀胱，以及來源于人、豬和牛的心包膜，已經可進行脫細胞化并制成商用支架[1]。同時，在基礎研究和臨床前研究中表明，還有大量的其他組織和器官已經經過脫細胞化，并應用于再生醫學的各個方面[2]。脫細胞化后遺留下的細胞外基質(ECM)，作為組織的結構支撐以及細胞內的生物化學和生物物理信號的來源發揮著關鍵作用。ECM通過這兩個角色指導細胞增殖、遷移、分化和行為[3]。每種組織的ECM為駐留細胞提供獨特的組織特異性微環境。這種干細胞龕已適應自然，為細胞提供了其發揮功能所需的結構和生化信號[4]。因此推測脫細胞組織材料對該組織來源的細胞分化應有明顯的影響。利用天然的干細胞龕引導細胞向特定的細胞譜系分化已經成為研究組織工程的熱門途徑。通過更加深入地了解脫細胞組織對細胞分化的影響，可以為細胞命運的控制和再生治療的發展提供一個更有用的平臺。本文將回顧制備脫細胞組織材料的不同方法和這些材料對細胞行為影響的研究，重點回顧細胞分化。這些材料可以是整個器官支架，ECM的切片或塊，水凝膠及涂層，且現已從以下組織中成功制備：肺，肝，腎及涎腺。

2 制備去細胞化組織材料的方法

2.1脫細胞方法 組織脫細胞化的目標是保留ECM中所有的結構和生化信號，并去除在宿主中引起不良炎癥反應和阻礙組織再生的細胞成分[2]。現有的組織脫細胞方案有機械、化學、酶解或去垢劑等不同方法[2,3]，在對上述方案進行了全面的比較后，還未找到對于每種組織均適用的最佳方案[2,5,6]。在選擇脫細胞化方案時，重要的是要認識到一種方法并不適用于所有的組織，因為不同的組織在ECM密度、細胞密度和基本形態都上是不同的[2]。簡單地說，凍融會影響ECM的超微結構，壓力技術可能會影響ECM纖維的機械性能，堿性和酸性的溶液會降解ECM成分，離子去垢劑則會破壞蛋白質之間的非共價鍵，且后期難以從基質中清除，酒精也被證明在ECM交聯膠原蛋白增加其剛度[1、2、6-8]。所有這些因素也會影響細胞與材料的相互作用，因為它們改變了細胞直接接觸的環境。因此，必須謹慎地為每種組織選擇理想的脫細胞方法，因為它會影響細胞向特定譜系分化的成功[9]。簡而言之，必須在設計和選擇最佳的脫細胞方案時仔細考慮，才可最終將組織材料進行加工。

2.2材料準備 雖然脫細胞的組織材料可以作為完整的器官保留下來，但也可以對它們進行進一步加工，比如：切割成小片或小塊，或溶解成液體制成水凝膠或基質涂層。每種組織都可以被加工成為不同類型的材料，并有不同的好處。當目標是設計一個可移植器官時，在去細胞化過程中保持整個器官的完整是很重要的。去細胞化器官維持著器官的宏觀和微觀結構以及自然的ECM組成，從而為器官的再細胞化和再生提供了平臺[1]。

如果不需要一個完整的器官進行研究，那么可以使用脫細胞的器官薄片作為一種更方便的方法來測試ECM對細胞的影響，因為其仍然保持組織的結構和生化組成。制作這種切片主要有兩種方法，一是先將整個器官去細胞，然后將其切成薄片；二是將未加工的器官切成薄片，然后再將切片脫細胞。片切脫細胞后的器官，必須先將其埋入瓊脂糖、OCT冷凍介質或石蠟中使其變硬[9-12]。然而，制作脫細胞化切片最常見的方法還是先將組織切成所需的厚度，然后再將切片脫細胞化。該方法已用于肌腱、腦、腎、肺、肝、角膜基質和真皮[21-26]。脫細胞材料也可以制成介于完整器官和器官薄片之間大小，例如骨組織的4×4×3 mm立方體[30]或筋膜組織的4×2×0.5 cm切片[31]。

脫細胞組織也可以進一步加工成水凝膠。水凝膠通常用于向損傷部位注射以促進組織再生，但它同時也是細胞培養的有利平臺，因為它們可以被大量制造，并且比ECM切片更容易存留細胞。制備方法根據實驗目的和需要修改的特性有很大的不同。這些方法包括使用脫細胞基質作為水凝膠的唯一成分、使用交聯劑，或者加用其他材料合成復合材料以進一步調節其性能。用胃蛋白酶對ECM進行凍干、碾磨和消化是一種將ECM作為水凝膠中唯一成分的常見方法。隨后將ECM置于常溫環境中形成水凝膠[26,32-36]。這些材料可單獨用于體內[32-35]或在體外創建2D及3D培養環境[36]。

ECM材料的最后一類是基質涂層。首先通過類似于制造水凝膠的消化過程，制作一種以ECM作為原料的液體，然后將ECM蛋白吸附到組織培養器材表面。細胞隨后被播種到涂層板或孔中，并與特定的生化信號相互作用。涂層類似于薄的脫細胞組織切片，其創建了一個2D平面來進行研究，但是卻不再維持組織的固有結構。

3 ECM對細胞分化的影響

每種組織都有其獨特的ECM組合物，并且以各種方式影響細胞分化。除了組織的結構，生化信號也在細胞命運決定中起著重要作用。現已經完成了多種實驗來研究這種與不同組織、細胞類型和條件的相互作用。

3.1肺 許多研究表明，脫細胞肺基質能夠促進更成熟的細胞類型(如祖細胞)向肺特異性細胞分化，而其他更原始的細胞類型則需要額外的信號才能開始向肺特異性細胞分化。Cortiella等人將小鼠胚胎干細胞(mESCs)接種到小塊的脫細胞大鼠肺基質上，并使用肺細胞培養基培養。然而，與對照組相比，肺ECM的孔隙度和剛度的差異，不足以得出差異是由于ECM本身，而不是材料的機械和傳輸性能的變化所引起的結論。在灌注生物反應器中觀察到，使用小氣道上皮生長培養基在全脫細胞大鼠肺中培養人源間充質干細胞(hMSCs)，肺上皮細胞標記物增加[13]。之前的研究中使用了補充劑來達到最后的結果。進一步的研究也表明，肺ECM需要添加培養基補充劑來誘導MSCs的向肺特異性細胞分化，而不能只使用常規生長培養基[10]。

3.2肝臟 多項實驗已證明，肝ECM能夠引導細胞向肝細胞分化或維持肝細胞表型。初步研究確定，在兩層脫細胞豬肝水凝膠間播種的人原代肝細胞，在觀察白蛋白分泌、轉運能力和氨代謝等功能特性時，其肝細胞表型與在基質凝膠上培養時一樣成功[18]。隨后的一項研究將人胎兒肝細胞和人胎兒衛星細胞在完全脫細胞的豬肝臟中灌注了13 d，并根據表型和基因分析顯示細胞有完全成熟為上皮細胞的趨勢[19]。

3.3腎臟 目前已應用脫細胞腎組織完成了多項實驗，用細胞灌注全脫細胞腎臟顯示了其在組織工程中應用的良好前景。當使用mESCs接種于一個完整的脫細胞大鼠腎臟時，在基質中內層血管細胞上可見上皮分化[20]。其表明腎基質對細胞分化有區域特異性作用。J.P.O′Neil等[35]人通過從豬腎臟的髓質、乳頭和皮質中直接制取ECM切片、水凝膠和培養基補充劑來檢測腎臟不同區域的區別，他們發現小鼠腎臟干細胞在每個腎臟區域具有不同的代謝活性、增殖和形態學差異。雖然分化不是直接測量的，但差異顯示，不同的機械或生化信號也可能對干細胞分化產生區域特異性影響。值得注意的是，這些研究中沒有一項直接得出結論說腎臟引起了腎特異性細胞的分化。另一項比較恒河猴腎臟和肺基質切片對hESCs的影響的研究表明，這兩種物質都引起了肺和腎標志物的增加，且兩者之間沒有顯著差異[22]。有學者[21]做了一項獨特的實驗，證明了脫細胞腎基質可以用于骨工程，因為保留完整的脈管系統為成骨細胞提供營養。在這項研究中，他們使用成骨介質將一個完整的脫細胞大鼠腎臟灌注入人類原代成骨細胞，并觀察到成骨細胞保持其表型并重建了腎基質。這些結果表明，人們對腎ECM干細胞龕及其如何影響分化仍知之甚少。

3.4涎腺 學者[27]通過去垢劑對大鼠頜下腺進行脫細胞，隨后將大鼠原代MSG細胞接種于其中，組織學染色及電鏡觀察顯示脫細胞頜下腺基質有助于細胞粘附，免疫熒光染色進一步證實了人工合成的頜下腺在體外顯示出了細胞分化的標記物。在另一項研究中，學者[28]將人涎腺上皮細胞(SGECs)在豬脫細胞腸基質上分別以2D和3D兩種形式進行單獨培養及同微血管內皮細胞共培養，免疫熒光及掃描電鏡的結果證實了在3D培養下，SGECs生長良好并形成了導管狀結構，并且表達α-amylase，CL-1以及AQP-5，而2D培養下的SGECs僅有α-amylase陽性表達，且3D培養中的α-amylase相關基因表達也明顯高于2D培養。最新的成果顯示，接種于大鼠涎腺脫細胞基質水凝膠上的大鼠涎腺干/祖細胞，經過水凝膠3D培養后，相較于平面培養，其α-amylase在蛋白水平的酶活性提升了高達14倍，然而對成熟導管干/祖細胞標志物表達有所下降，包括c-Kit，c-Met以及CD44。此外，細胞的基本上皮緊密連接標記物，例如CL-1，CL-3，Keratin 5，Keratin 18及E-cad在轉錄水平的表達經過在水凝膠內培養后恢復到了未經處理的涎腺水平[29]。這些研究都表明涎腺脫細胞基質能促進涎腺干/祖細胞向功能性涎腺細胞的分化。

4 目前存在的問題

以上研究針對每種組織類型都研究了一些同樣的問題，這些問題為每種組織自身提出了一系列繼續向前發展的挑戰。常見的實驗方法是探索脫細胞ECM的生化和機械信號在干細胞分化中的作用。這些研究為這些信號的效果提供了極為重要的洞見，但其成果往往局限于我們所能夠研究的機械和生化信號組合數量。ECM本身是極為復雜的機械生化信號組合，因此很難確定究竟是哪些特定的成分或組合導致某些細胞行為。此外，大多數在包含材料剛度的研究都局限于2D培養基，而非可能與生理學聯系更加緊密的3D培養基。

另一個常見問題是，分化是否存在組織或區域特異性影響。這些結果根據所比較的組織類型而不同。區域特異性在復雜器官內對分化的特殊影響，為所有脫細胞組織研究提供了一個有趣的假想，例如腎臟。即使不考慮區域特異性的研究，在創建樣本時也必須保持謹慎，因為可能存在潛在的區域成分差異，因此對分化的影響也不同。

根據所回顧的幾項研究，其他加工方法對ECM的影響也很重要。這為研究ECM效應提出了額外的挑戰，因為材料本身可以改變實驗結果。因此，繼續致力于改進其處理方法是很重要的，但是在比較結果時也要保持處理方法的一致性。此外，還需要對ECM進行更多的定量分析，如基于質譜分析的QconCat技術，以更嚴格地評估ECM的差異和處理后脫細胞的效率。

最后一個在許多組織類型中反復出現的主題是病變脫細胞ECM對材料誘導分化能力的影響。這不僅對理解疾病機制很重要，而且對提升脫細胞ECM材料的生產力也很重要。許多可用作脫細胞材料的人體樣本要么已經老化，要么已經患病。為了確保制作的ECM材料的一致性，必須徹底了解可能影響材料質量的因素(包括捐贈者的健康狀況和年齡)。

5 結 論

脫細胞組織材料在許多不同的應用中都取得了成功。目前這些材料的設計包括完整的器官基質、切片、塊、水凝膠和涂層。為了保持原有的結構，并結合所有有利于細胞分化的線索，還需進一步擴展用于創建脫細胞ECM的材料和方法[1-3]。每種組織在進行脫細胞和處理材料時都有自身的障礙，隨著新的組織用于脫細胞實驗，將會有新的挑戰需要克服。每種不同的材料類別對于特定的應用也有獨特的優點，完整器官基質可用于移植和器官替換；水凝膠最適合創建三維環境，可用于注射治療；切片和涂層有助于直接發現基質成分對細胞分化的影響。

總的來說，脫細胞材料對細胞分化有明顯的影響。迄今為止，肺、肝、腎、涎腺、及其他脫細胞組織在實驗室環境中顯示出對細胞分化有積極影響的跡象。然而，每種組織能引導細胞譜系分化的能力不同。肝臟組織表現出單獨使用ECM直接引導細胞分化的能力，且無需添加其他補充劑。其他組織對干細胞行為有影響，但需要額外的信號來控制干細胞朝組織特定譜系分化。這可能是由于獨特的組織微結構、脫細胞過程中改變的ECM結構及成分，或其他未知因素。因此必須進行進一步的研究，以便更充分地了解這些細節。

在設計脫細胞組織材料時，了解組織和材料類型之間的差異是極其重要的。盡管人們普遍認為ECM包含指導組織特異性基因表達的必要線索，但引導細胞分化需要許多因素，僅靠ECM可能不足以滿足所有組織工程目的。然而，現有的研究文章表明，脫細胞組織材料可以利用自然界自身的天然組分，成為一種強大的工具。隨著未來的研究和發展，該領域具有良好的潛力，為基礎和轉化組織工程研究提供強大的支持。