PCR檢測HBV前C/C基因啟動子區變異與肝細胞癌的關系

李彥偉

肝細胞癌(HCC)以中低分化程度為主，5年生存率7%至38%，預后較差[1]。而乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC的重要誘因，其中HBV前C/C基因啟動子區變異與HCC等病變密切相關[2]，但臨床對其引發HCC的具體機制尚不明確。本文納入35例HCC和35例HBV攜帶者，對比分析HBV前C/C基因啟動子區變異特點，探討其在HCC病變中的作用，報道如下。

資料與方法

一、 一般資料

納入本院35例HCC與35例HBV感染攜帶者作為研究對象。HCC設為觀察組，男、女分別22、13例；年齡18～65歲，平均(48.28±13.19)歲；BMI 17.5～23.0 kg/m2，平均(20.44±2.20)kg/m2；HBeAg陽性6例。HBV攜帶者為對照組，男、女分別19、16例；年齡18～65歲，平均(47.56±14.24)歲；BMI 18.0～23.5 kg/m2，平均(20.96±1.87)kg/m2；HBeAg陽性7例。兩組患者基本資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

二、 納入與排除標準

(一) 納入標準：(1)本研究納入HCC與HBV攜帶患者診斷標準分別參照指南和防治方案進行[3-4]；(2)入選患者均行HBV前C/C基因啟動子區檢測。

(二)排除標準：(1)合并酒精性脂肪肝和代謝性肝病患者；(2)合并有嚴重心腦血管疾病及甲狀腺功能異常者；(3)合并有惡性腫瘤者；(4)PCR擴增不成功者；(5)病歷資料不全者。

三、 檢測方法

(一) 實驗設備試劑：PCR擴增儀為美國賽默飛SimpliAmpTM熱循環儀梯度PCR儀，基因測序儀為NexSeqCN500基因測序儀，由杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司提供。Taq DNA多聚酶和DNA純化試劑盒購自北京奧維亞生物技術有限公司。參照GenBank HBV基因型保守序列進行引物設計，引物為PreS2(5′-GGGTCACCATATTCTTGGGAA-3′，2794-2814)和Pol10A(5′-GCAGCAAAGCCCAAAA-GACC-3′)。

(二) PCR擴增：以巢式PCR擴增檢測HBV前C/C基因，嚴格按試劑盒說明方法進行。抽取血清HBV DNA，后PCR擴增，94 ℃預變性2 min → 94 ℃變性30 s → 55 ℃退火30 s → 72 ℃延伸90 s → 35個循環 → 72 ℃延伸5 min。后進行產物純化及測序。用Seq Man軟件進行變異分析，與Gen Bank HBV相應基因序列進行對比記錄。

(三)HBV分型：用瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳處理，依據切片長度確定基因分型。

四、統計學方法

以SPSS 22.0進行統計學分析，計量資料以±標準差表示，行t檢驗，計數資料以百分比表示，行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、 PCR擴增結果

觀察組HBV前C/C子區24例發生變異，其中G1896 17例，G1899 7例，對照組HBV 前C/C子區7例，其中G1896 2例，G1899 5例，兩組HBV前C/C子區變異率差異有統計學意義(χ2= 19.586，P=0.000)。

二、 基因型分布結果

觀察組HBV前C/C基因啟動子區基因亞型中Ba型7例，C1亞型16例，C2亞型12例，對照組Ba型4例，C1亞型17例，C2亞型14例。兩組基因型分布無顯著性差異(χ2= 1.002，P=0.606)。

討 論

HBV感染可導致慢性肝炎的持續性進展和肝細胞異常增殖分化，成為癌變的潛在危險因素。另外，HBV感染后宿主免疫抵抗力下降，使HBV發生變異，這可使病毒避免免疫攻擊，為病毒復制創造條件，最終破壞宿主基因組，發生癌變。既往報道認為HBV前C/C基因啟動子區突變是肝功能惡化，HBV復制活躍的信號[5]，施海燕等[6]一項報道則指出HBV前C/C變異是加快慢性乙型肝炎患者肝纖維化病理變化的高危因素。

本研究顯示兩組HBV前C/C基因啟動子區變異率差異顯著，其中HCC患者以G1896變異為主，這可能是因前C/C基因啟動子區1896位核苷酸變異可使HBV逃過宿主免疫識別，破壞宿主原有基因組的平衡狀態，降低了患者對HBV感染的耐受性，使宿主肝細胞更易發生炎癥壞死，增加癌變風險。另外，G1896位點變異還可使HBeAg翻譯提前終止，進而發生HBeAg轉換，影響疾病進展。

另外，本研究還顯示HBV前C/C基因啟動子區亞型分布差異無統計學意義，這提示HCC的發生可能與HBV前C/C基因型并無顯著關系。可能是因HBV前C/C基因啟動子突變多發生于C亞型，而HCC患者亞型亦以C亞型為主。另外，本研究樣本量小，有報道還顯示HCC基因型分布與年齡、地域等因素有關[7]。因而，有關基因型分布與HCC的關系還有待今后擴大樣本量進行多因素分析觀察。