實(shí)時(shí)熒光定量PCR在HLA-B*5801等位基因檢測(cè)中的性能評(píng)價(jià)

吳 潔 伊 潔 甘 勇 徐英春*

目前，我國高尿酸血癥(Hyperuricemia，HUA)的患病率逐年增高，并呈年輕化趨勢(shì)，且HUA是痛風(fēng)的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[1]。當(dāng)血尿酸濃度過高時(shí)，單鈉尿酸鹽晶體就會(huì)在關(guān)節(jié)、軟骨和腎臟等部位沉積，導(dǎo)致痛風(fēng)發(fā)生。別嘌醇(Allopurinol)是常用的抑制尿酸合成，治療痛風(fēng)的一線藥物，是目前唯一的黃嘌呤氧化酶抑制劑。然而，該藥可引起嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)(severe cutaneous adverse reactions，SCARs)，如史蒂芬瓊森癥候群(Stevens-Johnson syndrome，SJS)、中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis，TEN)等，病死率高達(dá)20%～40%，尤其是伴有腎功能不全的患者，預(yù)后差，病死率高[2]。人類白細(xì)胞抗原B位點(diǎn)5801(human leukocyte antigen，HLA-B*5801)等位基因與別嘌醇引發(fā)的SCARs呈現(xiàn)很強(qiáng)的相關(guān)性，尤其在我國漢族人群中，HLA-B*5801陽性率較高，幾乎所有超敏反應(yīng)的患者都是HLA-B*5801等位基因的攜帶者，患者服用別嘌醇前進(jìn)行HLA-B*5801等位基因檢查，有助于預(yù)防別嘌醇所致SCARs的發(fā)生[3-4]。本研究旨在ISO15189實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可體系下，對(duì)使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法檢測(cè)HLA-B*5801等位基因進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，為此項(xiàng)目的臨床推廣和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究資料

選取2017年6月至2017年9月在北京協(xié)和醫(yī)院就診的20例高尿酸血癥患者，其中男性17例，女性3例；年齡23～64歲；平均年齡(42.1±15.2)歲；分別留取每例患者EDTA-K2抗凝靜脈全血樣本各500 μl(留取每例患者血常規(guī)檢測(cè)后剩余全血500 μl)。

1.2 儀器與試劑

采用SLAN96P型熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)；3730XL型測(cè)序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Thermo Multiskan GO核酸分析儀(美國Thermo Fisher公司)；NP968型全自動(dòng)核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)；全血提取試劑盒(西安天隆科技有限公司)。HLA-B*5801基因檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司，國械注準(zhǔn)20173403073)。

1.3 檢測(cè)方法

取200 μl的EDTA-K2抗凝外周血，使用NP968全自動(dòng)核酸提取儀及配套天隆全血提取試劑盒，按照說明書操作提取基因組DNA，使用Thermo Multiskan GO核酸分析儀測(cè)定提取DNA的濃度和純度，取濃度水平在10～100 ng/μl，OD260/OD280在1.7～2.0之間的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，置-20 ℃保存。按照HLA-B*5801基因檢測(cè)試劑盒操作步驟，采用實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)HLA-B*5801等位基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

將20例患者EDTA-K2抗凝靜脈血樣本送上海華大公司，用測(cè)序方法(金標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行驗(yàn)證，兩種方法進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果的總符合率、陽性符合率和陰性符合率，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性；選擇已知HLA-B*5801等位基因陽性和陰性的DNA樣本各2例，分別批內(nèi)批間重復(fù)擴(kuò)增10次，評(píng)價(jià)方法的精密度；對(duì)1例HLA-B*5801等位基因陽性DNA樣本進(jìn)行濃度梯度稀釋，獲得濃度為80 ng/μl、40 ng/μl、20 ng/μl、10 ng/μl、5 ng/μl、2.5 ng/μl和0 ng/μl的系列DNA樣本，采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)方法的最低檢出限。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法結(jié)果判定：每個(gè)樣本目的檢測(cè)信號(hào)為熒光基團(tuán)FAM，內(nèi)參信號(hào)為熒光基團(tuán)VIC。分析FAM和VIC信號(hào)的Ct值，并計(jì)算樣本檢測(cè)FAM信號(hào)Ct值與VIC信號(hào)Ct值的差值，其計(jì)算為公式1：

式中當(dāng)內(nèi)參Ct(VIC)≤20時(shí)，ΔCt≤4應(yīng)判定HLA-B*5801陽性；ΔCt＞4則判定為陰性。精密度實(shí)驗(yàn)中重復(fù)擴(kuò)增樣本Ct值的變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)按照平均值÷標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 重復(fù)性

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)4份DNA樣本的HLA-B*5801等位基因分別完成10次批內(nèi)批間重復(fù)擴(kuò)增，每份樣本重復(fù)檢測(cè)結(jié)果完全一致，所得Ct值的CV(%)均＜6.5%，見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)精密度

2.2 準(zhǔn)確性

在20份DNA樣本的HLA-B*5801等位基因檢測(cè)中，有8例HLA-B*5801陽性和12例HLA-B*5801陰性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序法結(jié)果的符合率為100%，其結(jié)果見圖1和圖2。

2.3 最低檢出限

圖1 HLA-B*5801陽性和陰性樣本的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

圖2 測(cè)序軟件分析判讀HLA-B*5801陽性和陰性樣本結(jié)果

濃度梯度稀釋DNA樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠?qū)舛鹊椭?.5 ng/μl的DNA樣本進(jìn)行有效擴(kuò)增，檢出HLA-B*5801等位基因，其最低檢測(cè)限為2.5 ng/μl的DNA。

3 討論

嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)(serious adverse drug reaction，SADR)在全球范圍內(nèi)造成高病死率、高醫(yī)療負(fù)擔(dān)和高醫(yī)患糾紛。據(jù)中國食品藥品監(jiān)督管理總局(China Food and Drug Administration，CFDA)統(tǒng)計(jì)，2016年全國藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)收到《藥品不良反應(yīng)/事件報(bào)告表》143萬份，其中新發(fā)和SADR報(bào)告42.3萬余份，安全用藥已成為迫切需要解決的公共醫(yī)療衛(wèi)生問題[5]。

別嘌醇是目前臨床常用治療高尿酸血癥、痛風(fēng)以及急性尿酸性腎病的一線藥物，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其可引發(fā)藥物過敏反應(yīng)，藥疹發(fā)生率為2%～5%，約有0.1%～0.4%的患者用藥后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重皮膚過敏反應(yīng)[6]。HLA-B屬于HLA I類基因，基因長度約為3.3 kb，有7個(gè)外顯子，中國人群中HLA-B有超過800種等位基因，HLA-B*5801屬于B類58亞型，01號(hào)等位基因。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)HLA-B*5801等位基因與別嘌醇引發(fā)的SADR反應(yīng)相關(guān)，尤其在高HLA-B*5801基因頻率的亞洲人群中[7-8]。2012年，美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology，ACR)建議：亞裔人群在使用別嘌醇前，應(yīng)該進(jìn)行HLA-B*5801等位基因快速PCR檢測(cè)[9]。

根據(jù)“藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)指南”的要求，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室在開展臨床檢測(cè)前均需對(duì)檢測(cè)體系進(jìn)行嚴(yán)格的方法學(xué)評(píng)價(jià)和性能驗(yàn)證，并建立相應(yīng)的性能規(guī)范，便于后續(xù)日常檢測(cè)過程中的校準(zhǔn)和室內(nèi)質(zhì)量控制工作，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確和可靠[10]。HLA-B*5801等位基因檢測(cè)屬于定性檢測(cè)項(xiàng)目，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的EP12-A2指南，定性檢測(cè)方法的最基本性能驗(yàn)證指標(biāo)包括精密度(重復(fù)性)、準(zhǔn)確度(突變型的檢測(cè)能力)和檢測(cè)限3個(gè)方面[11]。本研究中的重復(fù)性驗(yàn)證選取HLA-B*5801陽性標(biāo)本及陰性標(biāo)本各2例，分別進(jìn)行2 d共10次測(cè)定，陰性和陽性符合率均為100%。準(zhǔn)確性驗(yàn)證分別使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和測(cè)序法進(jìn)行HLA-B*5801等位基因測(cè)定，以測(cè)序法為金標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，且結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果一致，可準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)出HLA-B*5801陽性的患者。

4 結(jié)論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與測(cè)序法相比，其操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，成本較低，在臨床大批量的快速篩查工作中更為適用。最低檢出限驗(yàn)證結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光PCR能檢出稀釋濃度低至2.5 ng/μl的DNA陽性樣本，表明該方法具有足夠的檢測(cè)能力。

本研究通過對(duì)HLA-B*5801等位基因的重復(fù)性、準(zhǔn)確性、檢測(cè)下限等方法學(xué)性能評(píng)價(jià)和分析，證實(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可以滿足目前HLA-B*5801等位基因檢測(cè)的臨床需求，并且經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，適用于臨床常規(guī)檢測(cè)。