針刺對8-MOP/UVA誘導光老化模型小鼠皮膚SOD、MDA、T-AOC、LF、ATP酶的影響

王彩霞

(寧夏醫科大學中醫學院，銀川 750004)

皮膚光老化(Skin Photoaging)是指暴露部位皮膚長期受日光中紫外線照射所引起的皮膚外源性老化[1-2]，臨床表現為皮膚松弛、干燥粗糙、皺紋加粗加深、色素沉著異常、血管擴張、表皮角化不良及出現皮革樣外觀等，嚴重者可引起癌前病變甚至導致皮膚惡性腫瘤[3]，因此預防和延緩皮膚光老化已成為醫學研究的熱點之一。中醫針灸具有簡便、易行、省時、省力、無毒副作用等特點，近年來針灸抗衰老已成為中醫學研究的一個新領域?！白闳铩焙汀瓣P元”是防病抗衰的重要穴位，被稱為“保健穴”和“長壽穴”，具有健運脾胃、強壯機體之功，為治療諸虛百損的常用穴位。本研究利用1%甲氧沙林溶液(8-MOP)聯合長波紫外線(UVA)照射小鼠皮膚，建立光老化小鼠模型，通過針刺模型小鼠“關元”穴和雙側“足三里”穴，檢測其對皮膚組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、ATP酶活性及和脂褐素(LF)水平的影響，探討針刺抗衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康清潔級2月齡昆明種小鼠40只，雌性各半，體質量(20～25)g，均購自寧夏醫科大學實驗動物中心。

1.2 藥品與試劑

8-MOP，華邦制藥股份有限公司；維生素E膠丸，大連天宇奧森制藥有限公司。SOD試劑盒(批號20150525)，MDA試劑盒(批號20150308)，T-AOC試劑盒(批號20150503)，LF試劑盒(批號20150411)，ATP酶試劑盒(批號20150423)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

UVA燈管，紫外照射儀(Sigma公司)；UVA型紫外輻射計(北京師范大學光電儀器廠，波長范圍315～400 nm，波峰365 nm)；DK-420S型三用恒溫水箱(上海精宏實驗設備有限公司)；722分光光度計(上海第三分析儀器廠)；DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機(上海將來實驗設備有限公司)；TDL-5-A型離心機(上海安亭科學儀器廠)；MK3型酶標儀(Lab公司)；BLG10電子秤(上海精科天美科學儀器有限公司)。

1.4 方法

40只小鼠隨機分為空白組、模型組、針刺組、陽性對照組(維生素E組)4組各10只。用電動理發器剃除小鼠背部體毛，使其背部皮膚充分暴露，面積約2×2 cm，脫毛后第2天開始實驗?？瞻捉M將小鼠四肢捆綁固定在固定架上，每天涂抹1次雙蒸水，無其他任何處理；模型組做相同捆綁固定，并根據文獻[4]于小鼠背部皮膚暴露部位每天涂抹1% 8-MOP 1次，1～2 h后再給予190 v/w的UVA照射，累積照射時間138 h(累積強度為95 J/cm2)。照射過程中用紙扳遮擋小鼠頭部，照射結束后24 h內取皮膚；針刺組捆綁固定后，按照光老化模型制備方法進行操作，取小鼠“關元”穴及雙側“足三里”穴，定位及取穴方法參照余曙光主編的《實驗針灸學》[5]。采用32號0.5寸毫針在照射前30 min進行針刺，每穴持續捻轉刺激30 s，以小鼠不掙扎嘶吼并保持安靜為度,每次留針5 min，上述操作每天1次。陽性對照組(維生素E組)相同捆綁固定，采用維生素E膠丸涂抹造模部位。照射結束后24 h內取皮膚組織。

1.5 指標測定

治療結束后24內脫椎處死小鼠，立即取頸背部皮膚組織0.5 g左右，經預冷生理鹽水漂洗后除去多余脂肪和其他結締組織，制成10%的皮膚組織勻漿，測定其SOD、T-AOC、ATP酶活性和MDA、LF含量,嚴格按照試劑盒提供的方法測定。

1.6 統計學方法

2 結果

表1顯示，與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織SOD、T-AOC及ATP酶活性均降低(P<0.01)，MDA、LF含量均升高(P<0.01)。與模型組比較，針刺組、維生素E組小鼠皮膚組織SOD活性均顯著增強(P<0.01)，T-AOC活性明顯增強(P<0.01，P<0.05)，ATP酶活性明顯增強(P<0.01，P<0.05)， MDA含量顯著降低(P<0.01)，LF含量顯著降低(P<0.01)。

表1 各組皮膚組織中SOD、T-AOC、ATP酶活性及MDA、LF含量比較

注：與空白組比較：▲▲P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

皮膚衰老是一個復雜、多因素綜合作用的過程，包括內源性衰老和外源性衰老[6]。內源性衰老是指隨著年齡的增長皮膚出現自然老化的過程，外源性衰老主要指皮膚光老化，而紫外線是引起皮膚光老化最主要的影響因素[7]。紫外線在自然界由太陽輻射產生，按其波長可分為長波紫外線(UVA，315～400 nm)、中波紫外線(UVB，280～315 nm)和短波紫外線(UVC，100～280 nm)，其中UVC經過大氣層時被臭氧層吸收，對機體產生作用的主要是UVA和UVB[8]。而UVA穿透力極強，是UVB 的500～1000倍，可到達皮膚基底層與真皮層，是皮膚曬黑的主要原因[7]。本實驗采用8-MOPUVA聯合制備光老化小鼠模型，相比傳統常用的UVA聯合UVB或單純使用高劑量UVA照射大大縮短了造模時間，且皮膚照射損害相對較小，而皺紋卻明顯增加[9]。

目前認為，紫外線照射皮膚后可以產生高度反應的自由基，過量的自由基可攻擊細胞膜等生物大分子產生過氧化反應，形成多種脂質過氧化物及其代謝產物[10]。SOD是機體清除自由基的主要抗氧化酶，能減少氧自由基和過氧化脂質的生成，其活性的高低可直接反映機體清除自由基的能力；MDA是生物體內過氧化脂質的代謝產物，其含量的高低可反映組織細胞受自由基損傷的程度。生物體內MDA進一步侵害細胞生成LF，LF是具有光毒性的細胞內沉積物，它可在細胞生長衰老過程中逐漸積累，并造成細胞功能障礙，如沉積在動物皮膚細胞中，可使皮膚粗糙、黯淡、無光澤并產生皺紋、色斑等[11]。T-AOC可反映皮膚中酶與非酶的全部抗氧化物，是一個全面反映皮膚組織抗氧化能力的良好指標。ATP酶是一種蛋白酶，存在于組織細胞及細胞器膜上，它在物質運送能量轉換以及信息傳遞方面具有重要作用，是體現機體抗氧化能力的重要活性酶之一[12]。由此可見，上述指標(SOD、MDA、T-AOC、LF、ATP酶)是直接關切生物體內“氧化”損害與“抗氧化”的相關指標，而它們則有可能是引起或延緩皮膚衰老的關鍵因素。

中醫學認為，皮膚光老化的發病主要是由于五臟虛損、氣血不足、肌膚失養，或痰濁瘀阻腠理，復感光毒所致[13]。因此，正虛邪實是皮膚光老化的主要病機。針灸抗衰老的作用機制在于扶正固本、調節氣血的生成和運行，使氣充血旺，運行有度[14]。“足三里”穴是足陽明胃經的合穴，為回陽九針穴之一，具有補中益氣、健運脾陽、培土化元、強壯保健之功，屬后天之本，為健脾補虛培元之要穴[15]。“關元”穴為任脈穴位，是任脈與足三陰經的交會穴，具有培本固腎、調理沖任、補益精血之功，屬先天之本，是古今強壯保健的要穴，為歷代醫家所推崇。“關元”與“足三里”兩穴配合，既能充養先天又能培補后天，使先后天之本有機結合，使“正氣存內，邪不可干”，從而達到固護正氣、防病抗衰的目的[16]。