羅漢果黃酮干預運動大鼠骨骼肌FLK-1及BFGF表達的影響?

陳 功，莫偉彬，李國峰

(1. 廣西經貿職業技術學院基礎部, 南寧 530000； 2. 廣西師范大學體育學院 廣西 桂林 541004； 3. 藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室, 廣西 桂林 541004)

運動能致使骨骼肌產生運動適應性變化，其主要表現為骨骼肌肉的機能改變、肌肉脂肪代謝能力的改善和不同骨骼肌肉組織形態學變化等。而毛細血管中密度的增加是骨骼肌肉的代謝基礎，也是提高骨骼肌機能代謝的保障。而胎肝激酶1(fetal liver kinase，FLK-1)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibrolast growth factor，BFGF)是存在于肌纖維間質和毛細血管肌膜的一種特異性受體，是改善骨骼肌肉中毛細血管機能的重要因子。羅漢果為廣西桂北地區著名的八大桂藥之一，主要用于醫藥和飲料中，其果實中的甜苷、多糖、黃酮，塊根中的淀粉及其藥用成分等已有報道[1-2]。近年研究人員對羅漢果黃酮通過體外實驗發現，羅漢果黃酮(momordica grosvenori flavones, MGF)具有抗氧化活性[3]、清除自由基[4]、抗疲勞和降糖及降血脂[5]等作用。前期的研究發現，服用羅漢果黃酮可提高力竭游泳大鼠股四頭肌ATP酶的代謝和肌酸磷酸激酶的活性，并且通過光學顯微鏡對股四頭肌組織切片的觀察發現，羅漢果黃酮對保護股四頭肌細胞膜具有良好的作用[6-7]。本研究通過建立力竭游泳訓練大鼠模型，從能量代謝角度探討羅漢果黃酮對大鼠骨骼肌FLK-1及BFGF在骨骼肌肉中毛細血管機能信號通路或調控作用，旨在為羅漢果黃酮在運動實踐中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與藥物

SPF級SD雄性大鼠50只，體質量(210.3±3.2)g,由桂林醫學院動物實驗中心提供(許可證SYXK(桂)2013-0001)。飼養期間室內溫度(22±5)℃，濕度58%～70%之間，自由攝食和飲水。實驗藥物為葫蘆科植物羅漢果果實的提取物，主要由黃酮、甜苷、槲皮素等多種化學活性成分組成，淺黃色粉末，味極甜，純度>80%，熔點197～201 ℃(分解)，購于桂林興達制藥有限責任公司生產(批號20160603)。

1.2 儀器與試劑

PCR擴增儀(德國SENSO公司)；DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)；K241R離心機(英國Centurion公司)；DHZ-032R恒溫搖床(上海博彩科技公司)；化學發光成像系統(美國Carestream公司)；凝膠成像及分析系統(Bioserss-l805，上海山富科學儀器有限公司)。RT-PCR試劑盒(湖南晶科生物科技有限公司，批號20161019)；Trizol試劑盒(Sigma-aldrich，批號2016-52302)；考馬斯亮藍(Fluka 公司，批號T20130104)；FLK-1、BFGF及β-actin 抗體為鼠單抗(一抗體，武漢博士德，貨號分別為A00901，C201710，BM0627)；羊抗鼠HRP-IgG(二抗體，南京生興生物技術有限公司，貨號SN134)；PVDF 膜(Millipore公司，NO：K5NA8022C)。BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號P0012S)。

1.3 動物分組及模型

大鼠適應性飼養1周，隨機分為安靜對照組(NC)、運動對照組(ME)、運動+低劑量羅漢果黃酮組(MGFL)、中劑量羅漢果黃酮組(MGFM)和高劑量羅漢果黃酮組(MGFH)。動物模型是按照前期實驗動物模型[8]在120×70×60 cm玻璃箱進行游泳訓練，水深45 cm，水溫(28±2)℃。各訓練組(ME、MGFL、MGFM和MGFH組)進行1周的無負重適應性訓練后(20 min/d)，接著進行為期5周的力竭游泳訓練，大鼠于每天上午8∶00進行負重游泳訓練(大鼠每只尾部負自身體質量3%的鉛墜進行游泳[9])，運動至力竭(90 min/d)，每日1次，每周6 d，對于短時間內力竭的大鼠，撈出休息5 min 后再進行游泳訓練，使訓練時間不少于90 min。力竭標準：大鼠頭部沉入水下超過10 s仍不在返回水面；大鼠運動協調消失，在水中不定向亂竄，未達到10 s 亦定為力竭。

1.4 動物給藥量與取材

各組大鼠分別在訓練前30 min灌胃不同濃度的羅漢果黃酮溶液，羅漢果黃酮低、中、高劑量組劑量分別為100、200和400 mg·kg-1，灌胃體積為5.0 mL·kg-1，對照組灌胃等量生理鹽水，連續給藥 6周，每周6 d。訓練結束后，于次日8時經20%烏拉坦溶液(3 mL/kg)麻醉，迅速取下腓腸肌，并置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.5 RT-PCR法檢測FLK-1和BFGF mRNA表達

表1顯示，取150 mg腓腸肌進行勻漿，根據Trizol試劑說明書提取總RNA，并測定總RNA濃度和純度。然后取7.5 μL合成cDNA，其反應條件是(常溫10 min，42 ℃/30 min，90 ℃/10 min， 4 ℃/10 min)。引物根據基因庫同源基因序列進行設計，由上海生工合成。取cDNA產物 3.5 μL與FLK-1、BFGF與β-Actin合成引物進行PCR擴增反應，其反應條件為(95 ℃，30 s；94 ℃，30 s；退火(FLK-1, 56 ℃;BFGF, 55 ℃; β-Actin,40 ℃)30 s；72 ℃，1 min；35個循環)，72 ℃延伸5 min。最后，取15 μL PCR反應產物與上樣液充分混合，點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠板中電泳70 min。采用Bioserss-l805型凝膠成像系統進行成像分析FLK-1、BFGF和β-actin的光密度，其比值采用FLK-1、BFGF/β-actin表示。

1.6 Western Blot 法檢測FLK-1和BFGF蛋白表達

取150 mg腓腸肌經剪碎后液氮研磨，裂解液充分裂解后，經離心(4 ℃，10000 r/min，20 min)，取上層清液于EP 管中，并采用BCA法進行蛋白濃度定量，以40 μg總蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳，轉膜(電流14 V, 100 mA，轉印2 h)、封閉過夜后轉入PVDF膜上。加FLK-1、BFGF抗體(均為1∶1000)、β-actin抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜。加羊抗鼠IgG-Biotin(1∶1000)孵育50 min，經PBST 洗膜后，加ECL化學發光底物于膜上，5 min后置于轉移膜上進行曝光、顯影、定影，采用凝膠成像系統對FLK-1或BFGF與β-actin蛋白條帶的灰度掃描并用比值表示。

表1 引物序列與擴增長度

1.7 統計學方法

2 結果與分析

2.1 各組大鼠腓腸肌FLK-1和BFGF mRNA表達比較

表2顯示，腓腸肌ME組FLK-1 mRNA表達高于NC組(P< 0.05)，腓腸肌MGFM和MGFH組FLK-1 mRNA表達顯著高于ME組(P<0.01)。腓腸肌ME組BFGF mRNA表達顯著高于NC組(P<0.01)，MGFH組BFGF mRNA表達顯著高于ME組(P<0.01)。

表2 大鼠各檢測指標表達比較

注：與安靜對照組比較：aP< 0.05;bP< 0.01; 與運動對照組比較：cP< 0.05；dP<0.01

2.2 各組大鼠腓腸肌FLK-1和BFGF 蛋白表達比較

圖1表2顯示，腓腸肌ME組FLK-1蛋白表達顯著高于NC組(P<0.01)，腓腸肌MGFH組FLK-1蛋白表達高于ME組 (P< 0.05)。腓腸肌ME組BFGF蛋白表達顯著高于NC組(P<0.01)，MGFM和MGFH組BFGF蛋白表達均顯著高于ME組(P<0.01)。

圖1 各組大鼠FLK-1和BGGF蛋白表達比較

3 討論

胎肝激酶1(FLK-1)和堿性成纖維細胞生長因子(BFGF)是存在于肌纖維間質和毛細血管肌膜的一種特異性受體。FLK-1是血管內皮生長因子(VEGF)的不同受體之一，屬于酪氨酸激酶受體家族的第Ⅲ亞型。FLK-1的表達廣泛存在于機體組織的肝、肌肉、腦、心、肺和腎等組織中，具有介導骨骼肌內皮細胞存活，改善血管通透性(氧運輸)，活化、血管的形成和改變細胞形態的生物效應等作用。BFGF是機體內的一種血管生成因子和多功能生長因子，具有保護血管內皮層、參與機體生長發育和組織損傷修復等生理作用。它的表達主要存在于機體內的心肌、骨骼肌、大腦、肝、腎和腺等多種組織中，其中骨骼肌中BFGF的蛋白表達主要存在于毛細血管肌膜和肌纖維間質里[10]。此外，BFGF還能誘導VEGF受體的表達，從而增強VEGF的作用。在運動中骨骼肌組織的缺氧上調VEGF的表達，從而促進FLK-1受體的結合，維持血管功能的完整性[11]。BFGF在運動中表達的增加促進VEGF的產生，參與骨骼肌組織中毛細血管新生的過程[12]。陳紅英等[13]研究發現，FLK-1 mRNA表達上升能夠防治和改善大鼠再灌注損傷血管內皮功能紊亂。劉秀娟[14]研究發現，力竭訓練能上調大鼠腓腸肌BFGF mRNA表達，促進骨骼的損傷修復。徐瑾瑜[15]研究發現，通過補充丹龍醒腦方后能增強VEGF、FIL-1和BFGF的蛋白表達。曹麗[16]研究發現，通過7個月抗阻訓練后的小鼠VEGF、FIL-1和BFGF mRNA表達明顯增加，表明運動激活發展BFGF及FLK-1信號傳導通路和骨骼肌的代謝能力。本研究發現，運動對照組大鼠腓腸肌FLK-1和BFGF mRNA及蛋白表達均高于安靜對照組，提示運動可能促進骨骼肌血液的重新分配，增強骨骼肌的能量代謝和有氧工作能力。通過補充不同劑量的羅漢果黃酮后，低劑量組下調大鼠腓腸肌BFGF mRNA及蛋白表達，這可能是在運動中骨骼肌吸收并代謝羅漢果黃酮防止自由基的產生，保持能量動態平衡。但在高劑量組時大鼠腓腸肌FLK-1和BFGF mRNA及蛋白表達達到峰值，這些變化提示FLK-1和BFGF 表達量的升高與骨骼肌損傷、再生與修復可能存在著一定的關系，提示運動大鼠在羅漢果黃酮的干預下，有利于維持血管的完整性，增加肌肉組織供血能力和提高氧運輸能力，從而防止運動中肌肉的損傷，但其機制還有待深入研究。總之本實驗證明，運動中補充羅漢果黃酮能夠增加機體內肌肉組織供血能力和提高氧運輸能力，延緩運動疲勞的發生，同時為開發和應用羅漢果黃酮提供重要的科學依據。