番茄MYB-related 2基因克隆及過表達載體的構建

郝娟 段學粉 郭仰東 張喜春

摘 要 為分析SlMYB-related 2基因的生物學功能及為其抗冷害作用機制提供科學依據，從俄羅斯栽培番茄Bolgogragsky（實驗室種質編號25）中克隆SlMYB-related 2基因編碼區序列，對其進行生物信息學分析，然后構建基因過表達載體。結果表明，在俄羅斯栽培番茄Bolgogragsky的cDNA中克隆了SlMYB-related 2基因，全長1 248 bp，編碼415個氨基酸，并構建了基因過表達載體pBI-SlMYB-related 2。說明SlMYB-related 2基因對番茄冷害有響應，進一步推測其可能影響番茄御冷機制。

關鍵詞 番茄;MYB-related 2;過表達載體;冷害

中圖分類號：S641.2 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.32.102

番茄（Solanum lycopersicum）為管狀花目茄科番茄屬的一年生或多年生草本植物，受到人們的普遍喜愛，是全世界栽培較為廣泛的果菜。番茄是喜溫作物，不耐低溫，因此由低溫脅迫造成的損失尤其嚴重。近年來，植物低溫冷害問題越來越受到人們的關注。

MYB轉錄因子是指含有MYB結構域的一類轉錄因子，參與植物的生長發育、次生代謝以及相應的生物脅迫與非生物脅迫。在番茄中，轉錄因子S1MYBL2抑制了CHI酶的活性，使其下調，導致果皮中類黃酮含量下降，最終使番茄的顏色變為粉紅色。在蘋果中，MdMYBl、MdMYBl0和MdMYBA通過調節花青素的合成控制果皮和果肉的紅色性狀[1]。葡萄中VvMYBA2和VvMYBAl與啟動子相結合，抑制了花青素的合成，導致葡萄的顏色變為綠色[2]。擬南芥中的Atmyb2在高鹽條件下，表達量上升，刺激了干旱基因rd22和AtADHI的表達，增強了擬南芥對干旱的耐受力。在低溫脅迫中，擬南芥AtMYB 15對植物的耐低溫能力起負調控作用，過表達AtMYB15后，降低擬南芥對低溫的耐受力[3]。研究表明，在冷應激下，誘導MdMYB88和MdMYB124作用于CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1（MdCCA1）的上游和直接通過與其啟動子的AACCG基序結合來調節其表達，從而提高蘋果細胞的耐寒性[3]。

本試驗以番茄基因SlMYB-related 2為研究對象，克隆了基因的CDS區，并通過生物信息學軟件分析該基因的保守結構域及蛋白質性質，然后通過構建該基因的過表達載體，進一步探究SlMYB-related 2基因在番茄御冷機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為俄羅斯栽培番茄Bolgogragsky（實驗室種質編號25）。大腸桿菌菌株DH5α，PBI121載體來自于實驗室保存，DNA marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒均購于天根生化科技有限公司;Trizol? Reagent （Ambion）購于美國生命技術公司;TransScript?反轉錄試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司;PrimeSTAR Max Premix、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、T4 DNA連接酶及各種限制性內切酶均購于寶生物（Takara）工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因生物信息學分析

在NCBI數據庫中進行基因保守域預測，在PlantCARE網站進行啟動子分析，利用ExPasy Translate軟件推導出SlMYB-related 2全長cDNA的氨基酸序列，使用ExPasy Protparam軟件分析其理化性質。使用InterProScan、Consered Domains、Expasy Prosite軟件進行SlMYB-related 2蛋白質結構域及功能位點分析;使用PHDsec program軟件進行SlMYB-related 2蛋白的二級結構預測分析，SWISS-MODEL軟件進行SlMYB-related 2蛋白的三級結構預測分析。

1.2.2 基因克隆

利用Trizol法提取葉片RNA，然后將其反轉錄為cDNA。以cDNA為模板擴增SlMYB-related 2基因的全長CDS，PCR擴增反應體系為25 μL：cDNA 1μL，正向引物2 μL，反向引物1 μL，PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。條件為94 ℃預變性5 min，

94 ℃變性30 s，54.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34個循環。將PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收相應的目的片段。

1.2.3 植物過表達載體構建

切膠回收所得DNA和pLB中間載體進行連接并轉化到大腸桿菌DH 5α感受態細胞中，經卡那霉素篩選后挑取陽性克隆進行擴大培養，以pLB-Simple Vector特異引物為引物進行PCR驗證。

挑取分別含有pLB-MYB-related 2和pBI121質粒的陽性單菌落進行擴大培養，再分別提取質粒。將pLB-MYB-related 2和pBI121質粒分別進行Xba Ⅰ和Sma Ⅰ雙酶切。酶切產物經回收純化后過夜連接，轉化到大腸桿菌DH 5α感受態細胞中，在含Kan的培養基平板上挑取陽性克隆，擴大培養后提取質粒DNA進行序列測定。

2 結果與分析

2.1 SlMYB-related 2基因生物信息學分析

2.1.1 保守域分析

番茄MYB-related 2基因CDS序列長1 248 bp，編碼415個氨基酸。在基因編碼的氨基酸序列第44～100位存在典型的MYB轉錄因子的保守域，myb_SHAQKYF;且在第142～187位存在Myb_CC_LHEQLE轉錄激活域，均表明SlMYB-related 2符合植物MYB轉錄因子的基本特征。在第137～292位存在MscS蛋白超家族，表明SlMYB-related 2可能與細胞膜的作用有關。

2.1.2 編碼蛋白親疏水性分析

利用軟件ExPasy protscale對SlMYB-related 2編碼蛋白進行了親疏水性分析。結果顯示，SlMYB-related 2最大值為1.422，在第82個氨基酸殘基處;最小值為?2.667，在第301個氨基酸殘基處。

2.1.3 編碼蛋白結構與功能域分析

利用PRABI Lyon Gerland軟件進行SlMYB-related 2編碼蛋白二級結構預測，發現SlMYB-related 2中α-螺旋占34.7%，延伸鏈占7.47%，無規卷曲占56.14%，β-折疊占1.69%。使用ExPasy Prosite進行功能位點分析。結果顯示，SlMYB-related 2功能位點位于41～101位，氨基酸序列為TDAKPRLKWTPDLHERFIEAVTQLGGADkAtPKSVLKLMGIQGLTLYHLKSHLQKYRLSKN。

2.2 基因克隆

以番茄葉片cDNA為模板，對SlMYB-related 2基因進行克隆，經PCR擴增得到目的條帶（圖1），1%瓊脂糖凝膠電泳條帶與目的片段長度基本一致。

2.3 植物過表達載體構建

提取pBI121和pLB-SlMYB-related 2質粒，分別用Sma I和Xba I進行雙酶切，回收目的片段后用T4 DNA連接酶連接構建pBI-SlMYB-related 2過表達載體。利用PCR進行驗證，如圖2所示，得到預期大小約為1 258 bp的基因片段，說明該植物過表達載體構建正確。經測序驗證，如圖3所示，目的基因無突變等錯誤，可以用于后續實驗。

3 結論與討論

據世界糧農組織的統計數據顯示，我國是世界上番茄產量最大的國家，但番茄的不耐低溫為番茄產業造成了巨大的經濟損失。低溫會影響番茄的生長發育，從而進一步影響其外觀品質和口感。

本試驗克隆得到番茄SlMYB-related 2，全長1 248 bp，

編碼415個氨基酸。經生物信息分析學可知，其含有一個轉錄因子保守域，一個轉錄激活域且存在MscS蛋白超家族，由此可以推測其亞細胞定位結果，為蛋白質互作位置提供依據方向，從而探究該基因在番茄御冷機制中如何發揮作用。pBI121質粒是一種適用于植物遺傳轉化的表達載體，是雙元T-DNA載體。本試驗先將

SlMYB-related 2基因序列構建到pLB中間載體上，再將其與pBI121同時進行雙酶切、連接構成植物超表達載體pBI-SlMYB-related 2，經驗證其準確無誤可以進行后續試驗。這一結果表明，本試驗構建的pBI-SlMYB-related 2過表達載體在進行植物基因表達和功能研究中具有一定的使用價值。

參考文獻：

[1] Takos，AM，Jaffé FW，Jacob SR，et a1.Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples[J].Plant Physiol，2006，142（3）：1216-1232.

[2] Kobayashi S，Goto-Yamamoto N，Hirochika H.Retrotrans-

poson-induced mutations in grape skin color[J].Science，

2004，304（5673）：982-988.

[3] Walker AR，Lee E，Bogs J，et a1.White grapes arose through the mutation of two similar and adjacent regulatory genes[J].The Plant Journal，2007，49（5）：772-785.

（責任編輯：趙中正）