稻瘟菌激活蛋白對(duì)荷葉生長及活性成分的影響

陳勇輝 葉若松 龔金榮 曹根鳳

摘 要 為開發(fā)一種高效、環(huán)保、多功能的荷葉促生長劑，以荷葉為試材，研究稻瘟菌激活蛋白對(duì)荷葉生長及其抗氧化活性成分含量的影響。結(jié)果表明，經(jīng)濃度為2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白處理后，荷葉發(fā)芽率相比對(duì)照組提高了33%，培養(yǎng)30 d后荷葉數(shù)量較空白處理增加79%;同時(shí)，經(jīng)濃度為2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白處理后，與空白對(duì)照組相比荷葉中總黃酮、可溶性糖及生物堿含量分別提高72.2%、56.1%及59.1%，荷葉提取物的羥自由基清除率為87.3%。可見，稻瘟菌激活蛋白可有效促進(jìn)荷葉生長，增強(qiáng)其抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 稻瘟菌;激活蛋白;荷葉;促生長;抗氧化

中圖分類號(hào)：S567.239 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.32.077

荷葉（Nelumbinis folium），又稱蓮葉，在我國南北方均有分布，有上千年的食用歷史。荷葉營養(yǎng)豐富，除含有豐富的碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分外，還含有黃酮類、酚酸類、生物堿類等多種活性成分[1-2]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)界認(rèn)為荷葉性味苦寒，具有清解暑熱、涼血止血的作用。現(xiàn)代研究表明，荷葉中活性成分具有降壓降脂、抗病毒、抗氧化、抗衰老等多種功效[3-6]。

荷葉作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，提高其品質(zhì)可創(chuàng)造更多經(jīng)濟(jì)價(jià)值。植物免疫誘抗劑具有促進(jìn)植物生長、激活自身免疫系統(tǒng)提高抗病能力等作用，成為近年來生物防治的研究熱點(diǎn)。交鏈孢菌、稻瘟菌和鐮刀菌等多種真菌中存在一類具有誘導(dǎo)植物抗性、提高植物免疫力的蛋白免疫誘抗劑，稱為激活蛋白[7-8]。與宿主細(xì)胞表面某些激發(fā)子受體結(jié)合，通過胞內(nèi)信號(hào)分子級(jí)聯(lián)放大，激活植物自身免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)植物抵御病蟲害和自然脅迫的能力[9]。同時(shí)還具有提高發(fā)芽勢(shì)、促進(jìn)植物生長的特殊功能，故被認(rèn)為是一種環(huán)境友好型新型多功能生物農(nóng)藥[10]。

為明確激活蛋白在荷葉上的應(yīng)用效果，使用激活蛋處理荷葉并評(píng)價(jià)其促生和提高荷葉品質(zhì)的作用，旨在為植物免疫誘抗劑合理推廣應(yīng)用與荷葉的科學(xué)種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 稻瘟菌的培養(yǎng)與激活蛋白的純化

在無菌環(huán)境中，在PDA固體培養(yǎng)基上接種挑取的稻瘟菌菌絲，培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)3 d。轉(zhuǎn)入28 ℃搖床中的PDA液體培養(yǎng)基中，一直到獲得大量生長旺盛的菌絲體后收集菌絲，參考邱德文研究中的方法[11]，制備出植物激活蛋白母液2.5 mg·mL-1，存于冰箱中冷凍備用。

1.2 荷葉的培養(yǎng)與處理

荷葉種子平均分成3組，將種子進(jìn)行去殼處理，分別在不同濃度激活蛋白緩沖液（0 ?g·mL-1、1 ?g·mL-1、

2.5 ?g·mL-1、5 ?g·mL-1和10 ?g·mL-1）中浸種6 h后，清水洗滌種子兩次，于清水中25 ℃培養(yǎng)。7 d后移栽入營養(yǎng)土，水培培養(yǎng)，觀察長勢(shì)。荷葉幼苗用激活蛋白每7 d噴霧處理1次，30 d后取荷葉烘干磨成粉末，提取荷葉中活性成分。

1.2.1 荷葉總黃酮含量的測(cè)定

荷葉粉末加70%乙醇勻漿超聲破碎后，在80 ℃水浴中回流2 h，冷卻后過濾，取清液定容，用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，于510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁為標(biāo)樣得到回歸方程計(jì)算總黃酮含量，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，對(duì)比不同濃度激活蛋白對(duì)荷葉黃酮含量的影響。

1.2.2 荷葉可溶性糖含量的測(cè)定

采用邢穎等的方法提取荷葉中可溶性糖，取荷葉粉末，按1∶20的比例加入蒸餾水，90 ℃水浴提取兩次，每次2 h，抽濾，合并提取液。對(duì)比不同濃度激活蛋白對(duì)荷葉可溶性糖含量的影響[12]。

1.2.3 荷葉生物堿含量的測(cè)定

取荷葉粉末，按1∶40的比例加入90%乙醇，于80 ℃加熱浸提2.5 h。加氯仿萃取靜置，取水層濾液用氫氧化鈉調(diào)pH至9～10。用紫外可見分光光度計(jì)在281 nm測(cè)定提取液中的荷葉生物堿吸光度，以荷葉堿為標(biāo)樣得到回歸方程計(jì)算生物堿含量，對(duì)比不同濃度激活蛋白對(duì)荷葉生物堿含量的影響。

1.3 激活蛋白對(duì)荷葉羥基自由基清除作用的影響

采用的劉軍波等的方法對(duì)荷葉成分進(jìn)行提取，并使用水楊酸法測(cè)定經(jīng)不同濃度激活蛋白處理后的荷葉對(duì)羥基自由基的清除率[13]。羥基自由基的清除率計(jì)算公式如式（1）所示。

（1）

其中，A0為空白對(duì)照的吸光值，Ax為加樣品的吸光值，Ax0為不加顯色劑H2O2時(shí)樣品的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度激活蛋白對(duì)荷葉種子發(fā)芽生長的影響

觀察各組荷葉種子在相同環(huán)境及培育時(shí)間下的的發(fā)芽情況，結(jié)果如圖1所示：對(duì)照組種子發(fā)芽率為63.3%;經(jīng)濃度為2.5 ?g·mL-1的激活蛋白溶液處理的種子發(fā)芽率為84.4%;當(dāng)激活蛋白濃度上升至10 ?g·mL-1時(shí)，發(fā)芽率下降至53.3%。由種子發(fā)芽率可知激活蛋白濃度為

2.5 ?g·mL-1時(shí)蓮子發(fā)芽率最高，而激活蛋白濃度繼續(xù)上升時(shí)種子發(fā)芽率降低，可能原因是相對(duì)較高濃度的激活蛋白對(duì)荷葉發(fā)芽率有抑制作用。

如圖2所示，不同濃度激活蛋白處理的荷葉在相同條件下培養(yǎng)荷葉30 d后，激活蛋白處理組葉片數(shù)量與對(duì)照組比較也具有顯著性差異。經(jīng)濃度為2.5 ?g·mL-1的激活蛋白溶液處理的荷葉幼株，30 d時(shí)的葉片數(shù)量高出對(duì)照組79%。說明適當(dāng)濃度的稻瘟菌激活蛋白對(duì)荷葉的生長也有明顯的促進(jìn)作用。

2.2 不同濃度激活蛋白對(duì)荷葉黃酮含量的影響

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得荷葉中黃酮濃度見圖3。對(duì)照組荷葉中黃酮的濃度為24.98 mg·g-1;經(jīng)濃度為2.5 ?g·g-1稻瘟菌激活蛋白處理后，荷葉中黃酮的濃度為43.02 mg·g-1;經(jīng)濃度為10 ?g·mL-1稻瘟菌處理后，荷葉中黃酮濃度為18.33 mg·g-1。結(jié)果表明，2.5 ?g·mL-1激活蛋白溶液可有效提高荷葉中黃酮的含量，但經(jīng)高濃度稻瘟菌激活蛋白處理過的荷葉中的黃酮反而降低，說明高濃度激活蛋白會(huì)抑制荷葉中黃酮的產(chǎn)生。

2.3 不同濃度激活蛋白對(duì)荷葉可溶性糖含量的影響

采用蒽酮比色法測(cè)定荷葉中可溶性糖含量結(jié)果見圖4。未經(jīng)激活蛋白處理的荷葉中可溶性糖含量為8.54 mg·g-1;

經(jīng)濃度為2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白處理后，荷葉中可溶性糖的濃度為13.33 mg·g-1;而經(jīng)濃度為10 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白處理后，荷葉中可溶性糖濃度下降至

6.12 mg·g-1。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)激活蛋白能提高荷葉中可溶性糖的含量。

2.4 不同濃度激活蛋白對(duì)荷葉生物堿含量的影響

如圖5所示，未經(jīng)激活蛋白的荷葉中生物堿的濃度為0.164 mg·g-1;經(jīng)濃度為2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白處理后，荷葉中生物堿的濃度為0.261 mg·g-1，經(jīng)濃度為10 ?g·mL-1稻瘟菌處理后，荷葉中生物堿濃度為0.128 mg·g-1。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)激活蛋白對(duì)荷葉中生物堿的產(chǎn)生有一定促進(jìn)的作用。

2.5 激活蛋白對(duì)荷葉提取物清除羥自由基的影響

經(jīng)不同濃度稻瘟菌激活蛋白處理的荷葉提取物的羥自由基清除率如圖6所示。對(duì)照組清除率為75.36%;經(jīng)濃度為2.5 ?g·mL-1激活蛋白溶液處理的荷葉提取物清除率為87.3%，當(dāng)經(jīng)濃度為10 ?g·mL-1的激活蛋白溶液處理的荷葉提取物清除率為63.58%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著激活蛋白濃度的提高，可提高荷葉的羥自由基清除能力，從而提高荷葉抗氧化性。但高濃度激活蛋白會(huì)抑制荷葉羥自由基清除能力，可能是由于高濃度的蛋白會(huì)抑制荷葉中黃酮等抗氧化成分的產(chǎn)生。

3 結(jié)論

激活蛋白是從真菌中純化出的一類具有誘導(dǎo)植物抗性的新型蛋白激發(fā)子，具有提高植物免疫力的作用。本試驗(yàn)使用激活蛋白溶液處理荷葉，并證明在一定濃度范圍內(nèi)，激活蛋白可以促進(jìn)荷葉的生長，并提高荷葉中抗氧化活性成分的含量，從而提高荷葉抗氧化性。荷葉中黃酮類和生物堿類活性成分具有較高的藥用價(jià)值和保健功能，使用激活蛋白可以提高荷葉中活性成分含量和抗氧化性，從而提高荷葉的品質(zhì)。本研究結(jié)果不僅有利于荷葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也為激活蛋白的應(yīng)用提供新的思路和方法，為開發(fā)新型綠色農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：劉 昀）