紫杉醇誘導肝癌HepG2細胞凋亡中miR-224的表達

龍春頻 歐陽堅

【摘 要】 目的：分析紫杉醇誘導肝癌HepG2細胞凋亡中miR-224的表達。方法：選取我科學院肝癌細胞，即HepG2，對肝癌細胞進行培養以及藥物處理，然后采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測對凋亡細胞進行檢測，最終測定miR-224的表達。結果：通過檢測，發現紫杉醇濃度為2、1、1.5mg/L時，24h可誘導細胞凋亡，與空白對照組相比較差異明顯（P<0.05），48h更劇烈誘導細胞凋亡，凋亡細胞的比率表現更高;在miR-224的表達方面，通過實時定量PCR測定，紫杉醇濃度為2mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數明顯升高，但是當紫杉醇濃度為1mg/L或者1.5mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數明顯下降。而當紫杉醇濃度為1、1.5、2mg/L時，處理48 h HepG2miR-224的表達倍數均明顯升高。結論：紫杉醇誘導肝癌HepG2細胞凋亡時，miR-224表達上調，上調的miR-224可作用于其靶基因，進而對肝癌細胞的凋亡途徑造成影響。

【關鍵詞】 紫杉醇;誘導;肝癌HepG2;細胞凋亡;miR-224;表達

【中圖分類號】R285. 5

【文獻標志碼】B

【文章編號】1005-0019（2020）02-239-01

肝癌在臨床上比較常見，尤其是原發性肝癌，有數據顯示，我國原發性肝癌的發病率占全球發病率的55%左右，而死亡率占全球死亡率的45%[1]。紫杉醇是臨床上應用比較廣泛的一種高效廣譜癌癥化療藥物，其能夠作用于微管蛋白β亞基N端第31位氨基酸， 在促進微管聚合并穩定微管結構的同時，還阻止了其向亞單位的解聚，進而對微管聚合以及解聚的動態平衡造成了極大的影響，進而引發了癌癥細胞的凋亡或者死亡，另外，其還能夠對細胞膜超微結構進行改變，最后發揮出其抗腫瘤的作用。微小RNA則能夠對單鏈小分子RNA進行調控。本次研究就對紫杉醇誘導肝癌HepG2細胞凋亡中miR-224的表達進行了詳細的分析。具體如下：

1 資料與方法

1.1 對肝癌細胞的培養和藥物處理

選取我科學院肝癌細胞，即HepG2，取含有10%小牛血清的PRMI1640培養基對肝癌細胞進行接種，再將其放置在濃度為5%的CO2培養箱中，將培養箱的溫度調整為37℃，培養24h后，再將培養基換成濃度為2、1、1.5mg/L的紫杉醇，繼續培養24h和48h。

1.2 凋亡細胞的檢測

采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測法對凋亡細胞進行檢測，取Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，嚴格按照說明書進行操作。先取不含EDTA的胰蛋白酶對肝癌細胞進行消化，將血液離心儀的轉速調整為2000r/min，離心5min后，對鐵壁細胞1～5×105進行收集，然后用PBS對細胞進行洗滌，洗滌2次后在其中加入500μL的Binding buffer，再在其中依次加入5μL的Annexin V-FITC、5μL的Propidium Iodide后混勻，放在避光的環境下讓其反應5～15min。再用流式細胞儀進行檢測，將細胞儀的激發波長、發射波長分別調整為488nm和530nm，通過FITC通道對Annexin V-FITC綠色熒光進行檢測，通過PI通道對PI紅色熒光進行檢測。

1.3 miR-224表達的測定

定量PCR引物的設計與合成均通過Primer BLAST進行，對肝癌細胞中總RNA進行提取時，嚴格按照試劑盒中的說明書進行操作。采用TRIpure Reagent總RNA對RNA進行抽取和分離，將提取到的RNA用濃度為1.2%的瓊脂糖進行電泳，并用K5500超微量分光光度儀對其濃度和純度進行測定。將miRNA逆轉錄成cDNA，最后實時定量PCR擴增和檢測。

1.4 觀察指標

觀察肝癌HepG2細胞凋亡情況以及細胞中miR-224的表達。

1.5 統計學分析

采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，分別用均數標準差和%表示計量資料和計數資料，用t和χ2檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義，P>0.05表示差異沒有統計學意義為標準。

2 結果

2.1 肝癌細胞凋亡檢測結果

通過檢測，發現紫杉醇濃度為2、1、1.5mg/L時，24h可誘導細胞凋亡，與空白對照組相比較差異明顯（P<0.05），48h更劇烈誘導細胞凋亡，凋亡細胞的比率表現更高。詳見表1：

2.2 miR-224的表達

在miR-224的表達方面，通過實時定量PCR測定，紫杉醇濃度為2mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數明顯升高，但是當紫杉醇濃度為1mg/L或者1.5mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數明顯下降。而當紫杉醇濃度為1、1.5、2mg/L時，處理48 h HepG2miR-224的表達倍數均明顯升高。

3 討論

有研究人員經過大量的研究發現，miRNAs基因與肝癌的發生、治療以及患

作者簡介 ：龍春頻 ，男 ，漢族， 1970年 12月生， 江西萍鄉， 本科學歷 ， 高級講師，主要從事中藥與腫瘤的研究。

通訊作者： 歐陽堅，萍鄉衛生職業學院腫瘤研究實驗室，郵箱： jouyang168@163.com。

者預后評估等密切相關。其經常會出現在一些與腫瘤相關的易變基因環境中，但是又有一大部分存在于與癌癥相關基因區域，或者一些比較脆弱性的位點上。如果某類miRNA的靶基因是抑制癌癥的基因，當此類miRNA出現明顯的增加，靶基因表達減少時，就提示有可能出現了腫瘤。但是如果靶基因是致癌基因，當相應的miRNA表達減少，或者作用于靶點的突變導致癌基因表達異常增高時，則極有可能會導致癌癥的發生，此時，除了抑制癌癥的基因外，另外一部分則被認定為是致癌基因。有研究人員經過研究發現，miR-224是肝癌癌變相關的miRNA，這也進一步提示miRNA在體外和體內肝細胞中的表達是一致的，尤其可能在維持肝癌細胞惡性表型的過程中起著極其關鍵的作用[2]。

有研究人員認為，miR-224對細胞增殖的作用，遷移、侵襲以及肝癌細胞抗凋亡等均與靶基因密切相關，因此，可發現，在癌癥的發生發展中都涉及到了該DNA[2]。也有文獻報道顯示，在被檢肝癌組織中，均發現了肝癌組織中的miR-224其定量檢測結果顯示，該miRNA的表達也出現了明顯的增加。因此，也可認為肝癌組織中存在著明顯的miRNA表達水平的變化，而此種定時熒光定量RT-PCR法也為早期、準確的檢測肝組織是否發生了癌變提供了新的思路[3]。

本次研究結果顯示，當紫杉醇濃度為2、1、1.5mg/L時，24h可誘導細胞凋亡，48h更劇烈誘導細胞凋亡，凋亡細胞的比率表現更高。而在miR-224的表達方面，通過實時定量PCR測定，當紫杉醇濃度為1mg/L或者1.5mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數明顯下降，而當紫杉醇濃度為2mg/L時，處理24h HepG2miR-224的表達倍數明顯升高。但是當紫杉醇濃度為1、1.5、2mg/L時，處理48 h HepG2miR-224的表達倍數均明顯升高。這可能是因為剛開始使用低濃度的紫杉醇，會有一個適應期，細胞凋亡下過并不明顯，但是將紫杉醇濃度增高時，HepG2miR-224的表達會升高，進而引發了細胞凋亡[4]。

綜上所述，紫杉醇誘導肝癌HepG2細胞凋亡時，miR-224表達上調，上調的miR-224可作用于其靶基因，進而對肝癌細胞的凋亡途徑造成影響。

參考文獻

[1] 薛婭，耿文峰，伍春蓮.紫杉醇與白藜蘆醇單體及聯合用藥誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡的比較研究[J].西華師范大學學報（自然科學版），2016，37（04）：385-389+395.

[2] 單長民，孫業盈，李娟，等.紫杉醇誘導HepG2肝癌細胞凋亡中miR-224沉默凋亡抑制因子5基因的作用[J].解剖學報，2015，46（04）：521-527.

[3] 單長民，王東，李娟，等.初探紫杉醇誘導肝癌HepG2細胞凋亡中miR-224的表達[J].藥物生物技術，2014，21（06）：494-497.

[4] 單長民，李京敏，李娟，等.試驗用和臨床用紫杉醇誘導肝癌細胞凋亡的比較[J].安徽農業科學，2014，42（06）：1711-1713+1738.