羅漢果SgARF9基因克隆及其CRISPR/Cas9基因編輯載體構建

辛佳佳 周瓊 裴艷艷 李剛

摘要?[目的]研究SgARF9基因與羅漢果果實發育的關系。[方法]在轉錄組Unigene序列基礎上，對羅漢果SgARF9基因進行克隆，并結合CRISPR/Cas9基因編輯技術，構建以SgARF9為靶基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體。[結果]克隆得到SgARF9基因序列，且成功構建包含SgARF9基因靶點的編輯載體。[結論] 該研究為揭示SgARF9基因的分子生物學功能，明確其在羅漢果果實起始發育中的遺傳調控機制提供了基礎。

關鍵詞?羅漢果;基因編輯;SgARF9基因;克隆

中圖分類號?S188+.1文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）02-0119-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.032

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning of SgARF9Gene of Siraitia grosvenoriiand Construction of CRISPR/Cas9 Gene Editing Vector

XIN Jia-jia，ZHOU Qiong，PEI Yan-yan et al（College of Agriculture，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004）

Abstract?[Objective]To study the relationship between SgARF9gene and fruit development of Siraitia grosvenorii.[Method]The SgARF9gene of S.grosvenorii was cloned on the basis of transcriptome Unigene sequences，and the CRISPR/Cas9 gene editing vector which used SgARF9as target gene was constructed by combining with CRISPR/Cas9 gene editing technology.[Result]The sequence of SgARF9gene was cloned，and the gene editing vector which contained targets of SgARF9gene was successfully constructed.[Conclusion]This study laid a foundation for revealing molecular biological function of SgARF9gene and clarifying itsgenetic regulation mechanism during fruit initiatial development of S.grosvenorii.

Key words?Siraitia grosvenorii;Gene editing;SgARF9gene;Cloning

羅漢果（Siraitia grosvenorii）是我國特色的藥食兩用藤本植物，因具有雌雄異株發育生物學特性，必須人工授粉才能保證結實率，存在工作量大、成本高、產量低等問題，嚴重限制了羅漢果規?；N植與產業化發展，其重要成分甜甙Ⅴ在果囊和果皮中含量較高，種子中含量較少[1]。種子硬度高，難以粉碎，會影響甜甙提取。培育無需人工授粉且果實無籽羅漢果品系具有重要的現實意義。

研究表明，通過生長素類似物2，4-D誘導可獲得單性結實果實[2]，但生長素類似物誘導可能存在畸形果、安全隱患等弊端，目前未能得到推廣，從基因水平研究單性結實具有穩定遺傳、品質優良、無畸形果等優點，是單性結實品種獲得的可行性途徑[3]。

已有的研究表明，生長素響應因子ARFs基因對植物果實發育過程具有調控作用，番茄SlARF7基因對其果實發育具有調控作用[4]。番茄、擬南芥和茄子中ARF8基因與果實單性結實具有相關性[5-6]，黃瓜CsARF09基因在不同時期果實中有表達[7]。通過對羅漢果SgARF9基因克隆及功能驗證，探究其在果實發育中的調控作用，可為研究羅漢果單性結實提供基礎。

利用傳統的轉基因技術實現品種遺傳改良，會引入外來基因，風險性未知。而

CRISPR/Cas9基因編輯技術具有操作簡單、效率高等優越性[8]。借助新型CRISPR/Cas9基因編輯技術，可對植物自身基因的編輯，從而進行品種遺傳改良。利用CRISPR/Cas9技術對番茄SlIAA9基因和SlAGL6基因進行編輯，得知其分別與產生單性結實具有相關性[9-10]。通過對羅漢果SgARF9基因定點編輯，進行基因功能驗證，可明確其對羅漢果單性結實過程是否具有調控作用。

1?材料與方法

1.1?材料

于盛花期采取種植于廣西大學農學院試驗田的羅漢果果實，提取總RNA，反轉錄得到克隆模板cDNA。載體構建所用pYLCRISPR/Cas9Pubi-B、pYLsgRNA-AtU3b和pYLsgRNA-AtU6-1載體均為華南農業大學劉耀光教授惠贈。

1.2?儀器、試劑

電泳設備（DYY-10C型，北京六一）;PCR儀 （Long Gene，A300 Fast Thermal Cycler）;4 ℃冷凍離心機（盧湘儀，TGL-16 M）;2×Es TaqMasterMix（康為世紀）;TransStart FastPfu DNA Polymerase（全式金）;Trans TaqDNA Polymerase（HiFi）（全式金）;BsaI-HF內切酶（NEB）;T4 DNA連接酶（TaKaRa）。

1.3?引物序列?引物序列如表1所示，其中通用引物來自文獻引用 ，SP-L1 為測序引物[11-12]。

1.4?研究方法

1.4.1?SgARF9基因克隆及序列分析。

以羅漢果果實總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，以同科其他物種的ARF9基因序列為參考，設計引物對ARF9-5F/ARF9-5R，擴增SgARF9基因cDNA的5′端序列，并與已有的Unigene片段進行序列拼接，接著設計引物對ARF9HF/ARF9HR，對拼接序列進行擴增驗證，基因5′端擴增參考2×Es TaqMasterMix（康為世紀）說明書進行，基因擴增驗證參考TransTaqDNA Polymerase（HiFi）（全式金）說明書進行，并利用MEGA7和GENEDOC軟件對序列進行比對分析、作圖。

1.4.2?CRISPR/Cas9基因編輯載體的構建。

1.4.2.1?靶點接頭的選擇。

載體構建過程參考文獻[12]略有改動，在SgARF9基因不同區域選擇2個合適的靶點序列，分別為ARF9-1：CAGTCCTGATCCTTGCATCC;ARF9-2： TGCTACTGCATCTCATGCCG，并經在線軟件RNA Folding Form （http：//mfold.rna.albany.edu/？q=mfold/RNA-Folding-Form2.3）分析，設計靶點正反向接頭引物。

1.4.2.2?靶點接頭制備及酶切-連接反應。

各取10 μL 的10 μmol/L正反向接頭引物，加入到80 μL 0.5× TE溶液中混合均勻，將上述混合液置于PCR儀器中， 90 ℃保溫 30 s，25 ℃孵化5 min左右，完成退火。將制備的靶點接頭SgARF9-1、SgARF9-2分別與表達盒載體pYLgRNA-AtU3b和pYLgRNA-AtU6-1進行酶切連接，連接產物分別命名為SgARF9-2-AtU6-1-gRNA、SgARF9-1-AtU3b-gRNA。反應體系和程序如下：靶點接頭，0.5 μL ;1×BsaI-HF Buffer，9 μL;10 mmol/L ATP，1 μL; 20 ng/μL 的pYLsgRNA-AtU3b或pYLsgRNA-AtU6-1質粒，1 μL;BsaI-HF，0.25 μL;35 U/μL T4連接酶0.5 μL;37 ℃ 5 min，20 ℃ 5min，5個循環[8，12]。連接產物于-20 ℃冰箱保存備用。

1.4.2.3?兩輪PCR擴增。

以上述酶切-連接產物作為第一輪巢式PCR擴增的模板，第一個反應利用啟動子上游引物UF和靶點反向特異引物ARF9-1R、ARF9-2R擴增;第二個反應利用靶點正向特異引物ARF9-1F、ARF9-2F和sgRNA下游引物gR擴增，兩步PCR擴增反應體系如表2所示[8，12]。PCR反應程序：95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s，（Tm-5） ℃ 20 s，72 ℃（時間據片段大小定），30個循環;72 ℃，5 min，4 ℃，∞。

在第二輪擴增中選取2組通用引物對，擴增上述PCR產物片段，擴增產物可以連接到雙元表達載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-B中。以第一輪PCR擴增產物為模板，按照表3所示反應體系，利用通用引物對B1/B2和B2/BL進行PCR擴增：分別以SgARF9-1-AtU3b-gRNA的兩步擴增產物混合樣為模板，用引物對B1/B2進行第二輪PCR擴增;分別以SgARF9-2-AtU6-1-gRNA的兩步擴增產物混合樣為模板，用引物對B2/BL進行第二輪PCR擴增[8，12]。PCR反應程序：95 ℃ 2 min;95 ℃20 s，（Tm-5） ℃ 20 s，72 ℃（時間據片段大小定），30個循環;72 ℃ 5 min4 ℃，∞。

1.4.2.4?擴增產物的酶切連接及轉化。將上述PCR擴增產物純化回收，與pYLCRISPR/Cas9Pubi-B表達載體酶切連接，反應體系如下：10×Cut Smart Buffer1.5 μL;10 mmol/L ATP，1.5 μL;pYLCRISPR/Cas9Pubi-B載體質粒60～80 ng/μL，1 μL;第二輪PCR回收表達盒擴增產物（10～15 ng/表達盒）1 μL;BsaI-HF內切酶0.25 μL;T4-DNA連接酶35 U/μL，1 μL;加RNAase-free H2O至15 μL。PCR反應程序：37 ℃ 5 min，10 ℃ 5 min，20 ℃ 5 min，15個循環;37 ℃ 5 min[8，12]。連接產物命名為 SgARF9/9-Atu3/6-sgRNA-CRISPR-B。根據大腸桿菌感受態DH5а（全式金）說明書進行載體轉化，并送公司測序確認。

2?結果與分析

2.1?基因克隆

在羅漢果轉錄組測序基礎上，克隆得到SgARF9基因的cDNA序列片段（圖1）。對拼接序列擴增驗證測序后，在測序結果中選取序列，并進行氨基酸比對分析后得知，羅漢果SgARF9序列與同科其他物種的ARF9序列相似性較高，靶點所在區域對應蛋白序列與其他ARF9序列的比對分析結果如圖2所示，并分別在序列相似度較高和較低的區域對應的基因序列中選擇2個靶點（圖3）。

2.2?靶點接頭二級結構?由圖4中a、b可知，靶點ARF9-1、ARF9-2與sgRNA均不存在連續6 bp以上的匹配區，可用作打靶位點構建打靶載體。

2.3?巢式PCR擴增

通過兩輪PCR擴增，得到特異性擴增產物。擴增結果如圖5所示，泳道1、2、3、4為第一輪PCR擴增結果，引物對UF/ARF9-1R、UF/ARF9-2R擴增結果分別為泳道1和4所示，引物對ARF9-1F/gR、ARF9-2F/gR擴增結果分別為泳道2和3所示，泳道5和6分別為第二輪PCR中引物對B1/B2和B2/BL擴增結果。