植物病原菌多聚半乳糖醛酸酶的研究簡述

張小秋，宋修鵬，陳冠州，王澤平，雷敬超，梁永檢，李楊瑞，黃冬梅，顏梅新

（1.廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所/中國農業科學院甘蔗研究中心/農業部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007；2.廣西北海市蔬菜研究所，廣西 北海 536000；3.廣西南亞熱帶農業科學研究所，廣西 崇左 532415）

植物細胞壁是抵御病原菌入侵的主要屏障。病原菌通過分泌一系列的細胞壁降解酶降解寄主植物的細胞壁，以突破屏障入侵寄主植物［1］。多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG；EC 3.2.1.15）是一種重要的細胞壁降解酶，廣泛存在于細菌、真菌和植物中。PG通過降解植物細胞壁中的同源多聚半乳糖醛酸，使植物組織浸解，導致原生質體死亡，在病原菌侵染寄主引起病癥過程中有著關鍵作用。PG是一種細胞壁結合蛋白，首次從致病真菌的離體細胞壁中獲得，作用是催化果膠α-（1，4）多聚半乳糖醛酸的裂解［2］。

1 PG的分類與特征

PG是降解植物果膠骨架結構的主要酶之一。根據底物位置的不同，PGs可分為內切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）、外切多聚半乳糖醛酸酶（exo-PG）或鼠李糖半乳糖苷酶（olio-PG）。endo-PG能隨機地從多聚半乳糖醛酸鏈內部消解α-1，4-糖苷鍵，產生聚合度為10-14的寡居半乳糖醛酸，對底物特異性較強。exo-PG能從寡聚半乳糖醛酸鏈的非還原末端消除單個半乳糖醛酸，產生聚合度逐步降低的寡聚半乳糖醛酸鏈和半乳糖醛酸單體，對底物特異性較弱［3］。endo-PG可降解細胞組織引起細胞死亡［4］，且產生的寡居半乳糖醛酸是激發植物防衛反應的激發子［5］。exo-PG可降解由endo-PG產生的激發子物質，并轉變為其它細胞壁降解酶的誘導劑［6］。有學者認為復雜的endo-PG形式可能使病原菌增加降解效率、擴大寄主范圍的能力［7］。

不同來源的PG序列具有很大的差異。細菌PG之間的相似性很低，但Erwinia carotovora病原菌中的兩個endo-PG具有95.5%的相似性，其余序列間的相似性為11.7%～58.7%。相同作用方式的PG序列的相似性高于不同作用方式的PG序列。細菌exdo-PG間的相似性為29.1%～58.7%，endo-PG間的相似性為39.3%～95.5%。另外，同一物種不同作用方式的PG間的相似性也很低［8］。真菌PG序列之間具有較高的相似性，相似性大小范圍在11.3%～100%，同一類型PG之間相似性較高，不同類型之間相似性很低，一般在10%～20%之間。真菌PG有多個完全保守的芳香族的氨基酸殘基，endo-PG和exo-PG還有各自特異保守片段和殘基［8，9］。據報道，PG的進化源于生態對策，是與植物的免疫反應協同進化的［10］。

多數真菌的PG是多基因編碼的［11］，ORF編碼區被內含子分隔，內含子最多可達7個。PG的前體蛋白N端信號肽一般為 7～16AA，個別如曲霉菌的PGC有一個較長的N端信號肽（40AA）。大多數真菌PG的分子量為20～60 kDa，等電點偏酸性［12］。

2 PG活性及致病性

不同病原菌的PG的理化性質不同。小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）PG在pH4～12范圍內均具有活性，pH6.0時活性最大；對熱不穩定及對胰蛋白酶和蛋白酶K敏感，對紫外線和氯仿亦敏感［13］。蟠桃褐腐病原菌（Monilinia fructicola）PG在28℃條件下活力最高，在pH 7.0時活性達到最高，培養5 d時的酶活力最高［14］。水稻病菌（Rhizoctonia solani）PG的產生受培養時間、溫度、碳源、葡萄糖濃度和pH的影響，其活性受緩沖液pH和溫度的影響。葡萄糖是PG的最適碳源，但葡萄糖濃度大于5%時，PG的產生受到抑制。當緩沖液50℃，pH5.0時，PG活性最高。PG遇強堿、強酸、氯仿、高熱、紫外線、胰蛋白酶和蛋白酶K等均不穩定［15］。

PG是病原菌定殖寄主與產生致病性的必需因子。Jurick等［16］發現氯氮卓青霉菌（Penicillium solitum）PG在其侵染寄主的前期有著重要的作用；Li等［17］在畢赤酵母中表達辣椒疫霉（P.capsici）的PG體外重組蛋白，發現重組蛋白能侵染辣椒表現癥狀；Isshiki等［18］研究發現鏈格孢菌（Alternaria citr）endo-PG的突變降低了病原菌對柑橘和馬鈴薯的致病力。灰葡萄孢缺失Bcpg1后，其在不同寄主上的致病力下降［19］，麥角菌（Claviceps purpurea）endo-PG失活后，幾乎喪失了對黑麥的致病力［20］，說明PG在病原菌產生致病力中起到重要作用。

PG活性對病原菌的致病力有影響。孫文秀［21］研究了大豆疫酶根腐病菌（Phytophthora sojae）中的PG活性對其致病力的影響，發現致病性菌株的PG活性明顯高于非致病菌株的。王麒然等［22］測定了花生葉腐病菌（Rhizoctonia solani Kühn）離體條件下和活體內病菌分泌的細胞壁降解酶活性與變化，發現果膠酶中的PG酶活性強，感病花生品種中測得的細胞壁降解酶活性一般都比抗病品種高。蓮腐敗病菌在侵染寄主過程中可產生多種細胞壁降解酶，以PG活性最高，且強致病性菌株的PG活性顯著高于弱致病性菌株［23］。李萍等［24］也發現PG活性的高低與辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）致病力的強弱相關，試驗菌株接種辣椒苗復壯后的PG活性高于復壯前；強致病力菌株的PG活性明顯高于弱致病力菌株。崔佳等［25］構建了玉米彎孢葉斑病菌（Curvularia lunata）Clpg1基因敲除突變體ΔClpg1，發現ΔClpg1突變體的PG活性降低，致病力減弱，說明Clpg1基因調控了玉米彎孢葉斑病菌的致病性。

PG的糖基化位點與其致病性有重要作用。通過預測發現PG的一級結構具有不同數量和類型的可能N-糖基化位點。李艷青等［26］突變了辣椒疫霉（P.capsici）PCIPG2 N-糖基化的3個潛在位點（N34、N76、N137），并表達了這些突變蛋白及測定其活性，發現N-糖基化在PCIPG2酶活性上起直接作用，使得PCIPG2酶在較低水平上保持較高的穩定性。單個的PCIPG2糖基化位點N34、N76、N137 對PCIPG2的致病性起正調控作用，而3個糖基化位點相互協調的功能抑制PCIPG2的活性，在PCIPG2表達致病過程中起負調控。曲霉（Aspergillus spp.）和寄生疫霉（P.parasitica）的PG利用N-糖苷酶F去糖基化后分子量降低，蛋白酶活性完全喪失［27，28］。

3 PG的表達調控

大多數真菌的PG屬于分泌型胞外酶，有誘導物存在時才能分泌PG，果膠、聚半乳糖醛酸等均能誘導PG的分泌。但葡萄糖、Ca2+、PG抑制蛋白（PGIP）則抑制PG的分泌［29］。Aspergillus glavus的PG基因在含果膠培養基中被誘導表達，而葡萄糖卻不能誘導其表達。Colletotrichum lindemuthianum侵染寄主后，其PG的轉錄活性迅速上升［30］。香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）生理小種4和生理小種1在柑桔果膠或PGA提供碳源時，PG活性加強，以葡萄糖或CMC作為唯一碳源時，PG活性很低［31］。核盤菌（Sclerotinia.Sclerotio－rum）在1%橘皮果膠培養基中被誘導表達，PG活性不斷提高，并在第7d活性達到最高［32］。PG基因可能與同家族內其他基因協同作用。許春景等［33］通過基因敲除技術，研究發現多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能與同家族內其他基因協同作用，通過調節果膠酶活性參與蘋果樹腐爛病菌致病過程。

4 PG基因的克隆表達

目前克隆表達了多種病原菌的PG基因。GarciaMaceira等［34］從番茄專化型F.oxysporum.f.sp.lycopersici（FOL）中克隆了pg5基因，推測其氨基酸為35 kDa，pI 8.3，過表達獲得35 kDa具有活性的PG蛋白。李洋等［35］利用同源克隆技術克隆了馬鈴薯軟腐病（Erwinia carotovora subsp.carotovora）peh基因，在原核表達中表達并測定得到其酶活性0.024 U·mL-1·min-1。趙艷琴等［36］克隆了煙草靶斑病菌的endo-PG1和endo-PG2的cDNA全長，序列分析表明endo-PG1和endo-PG2的推測蛋白均具有PLNO3003基因家族保守結構域，其跨膜結構間存在差異，表達受與煙草互作的誘導。吳偉懷等［37］首次從劍麻斑馬紋病菌中獲得了5個PG基因，并分別命名為Szpg1～Szpg5，均存在于被檢測的劍麻斑馬紋病菌中。龔鑫等［38］利用RT·PCR結合RACE方法克隆了蓮腐敗病菌的pg1全長cDNA，獲得一個編碼371個氨基酸的完整開放閱讀框。在畢赤酵母表達系統中構建了PG1同工酶的真核表達載體，經甲醇誘導分泌出胞外蛋白PG1，分子量大小約為38kDa。 由書妍等［39］表達了柑橘綠霉病菌（Penicillium digitatum）的PdPG2基因，PdPG2基因是酸性表達基因，其表達量隨著pH升高而降低，pH3.0時表達量提高至對照的10倍，pH8.0時表達量下降至對照的0.36倍。劉震等［40］通過實時熒光定量PCR技術分析了玉米彎孢葉斑病菌PG基因（Clpg）在病原菌-寄主植物互作時期的表達情況，鑒定獲得Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4基因，Clpg1基因的表達先升高后下降，Clpg2、Clpg3和Clpg4基因的表達逐漸上升。

5 PG活性的抑制

PG活性受到多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIPS）的抑制。PGIPS是病原真菌分泌的endo-PG的抑制劑。病原菌侵染過程中上調表達endo-PG基因，在某一階段降解植物細胞壁以獲取營養供自身營養［41］。為了抵御病原菌的PG，植物產生PGIPS與PG互作，過量表達的PGIPs激活茉莉酸代謝和β-1，3-葡聚糖酶表達，抑制水楊酸表達，引起細胞內信號轉導、轉錄重組和防御代謝等合成表達，以抵御病原菌的入侵［42］。PGIP富含亮氨酸，與PG酶非競爭性地、特異性地結合，以抑制PG酶的活性，提高植物的抗病性。

PGIP的含量、分布差異與植物的抗病性有關。PGIP可能更多地在植物生長的幼苗期對病原真菌起防御作用。阮期平等［43］測定小麥品種的抗赤霉病性與PGIP含量和分布的關系，發現小麥品種對赤霉病的抗性越強，PGIP含量越高、分布越廣；噴灑小麥禾谷鐮于SW89-2589小麥品種的幼苗上，發現葉感病較為嚴重，其次是根，莖幾乎不感病，PGIP在莖中的含量最高，其次是根，葉中最少；比較了抗病性不同的2個小麥品種，發現感病品種的PGIP含量較少，抗性較強的品種的PGIP含量較高。

PG活性受到兒茶素、酶類物質、韭菜汁、NO等的影響。研究表明兒茶素在棉苗對枯萎病抗性中的作用時，發現兒茶素可抑制枯萎病菌的菌絲生長、產孢及孢子萌發 ，對培養液中病菌的PG有抑制作用［44］。酚類物質對哈密瓜兩種主要致腐病原產生的細胞壁降解酶活性的影響，發現鄰苯二酚、對苯二酚、對羥基苯甲酸丁酯均能明顯地降低匍枝根霉和半裸鐮刀菌產生多聚半乳糖醛酸酶，對這些酶的活性也有明顯的抑制作用［45］。楊靜美等［46］測定了不同濃度的韭菜汁對香蕉枯萎病菌4號生理小種的PG影響，發現韭菜汁液濃度的增加對PG活性的抑制作用增強。吳斌等［47］研究發現，NO能抑制香蕉果實中PG的活性。

6 結語

植物病原真菌PG的種類、分子進化、基因特征分子生物學等特征得到了較為深入的研究，但植物病原細菌的PG研究較真菌PG少，且PG的致病性機制及其在致病過程中與寄主間的互作有待深入研究。