微波輔助苦蕎中蛋白和黃酮的同步提取工藝

董丹，楊芙蓮，張歡

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

蕎麥分為甜蕎和苦蕎，苦蕎富含人體所必需的8種氨基酸，是糧食中氨基酸含量之首[1]，高于大米、小麥、玉米和高梁中的蛋白質，它的氨基酸含量為10.21%[2]。Tomotake等[3]研究表明蕎麥蛋白具有較強的降血脂效果，植物蛋白粉在醬油、雞精、雞粉、湯料等制品中具有廣泛的應用[4]。蕎麥中也含有其他谷物中沒有的蘆丁、槲皮素等生物類黃酮，在食品加工中廣泛用于各種糕點、調味食品和保健食品的生產[5]，而且在抗病毒、抗腫瘤、抗心腦血管疾病等方面發揮著重要的作用[6]。此外，黃酮類物質還是香辛料植物的有效成分[7]。目前，苦蕎蛋白的提取方法有：堿溶酸沉法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等[8,9]。黃酮類化合物的提取方法有：堿溶酸沉法、超聲輔助法、微波輔助法、酶法等[10-13]。目前，還沒有對苦蕎蛋白和黃酮類化合物同步提取的研究。本試驗利用堿作為提取劑，對苦蕎中蛋白和黃酮進行微波同步提取，為苦蕎蛋白和黃酮類物質的生產提供了技術參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

苦蕎麥：橫山縣陜北大地農業科技發展有限責任公司；蘆丁標準品、考馬斯亮藍G250(分析純)：源葉生物有限公司；亞硝酸鈉(分析純)：天津市福晨化學試劑廠；氫氧化鈉、硝酸鋁、無水乙醇、磷酸、石油醚(分析純)：天津市天力化學試劑有限公司；牛血清白蛋白(生化試劑)：天津市化學試劑四廠；鹽酸(分析純)：洛陽昊華化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

儀器與設備見表1。

表1 儀器與設備Table 1 Instruments and equipments

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

苦蕎麥→烘干→粉碎→脫脂→堿水溶解→微波處理→離心→上清液→酸沉→沉淀→干燥→蛋白和黃酮提取物。

1.3.2 操作要點1.3.2.1 烘干

將苦蕎麥清洗后置于烘箱中于50 ℃干燥，粉碎過篩。

1.3.2.2 脫脂

將蕎麥粉與石油醚(沸程30～60 ℃)按1∶8的比例混合，于室溫下攪拌1 h，回收石油醚。

1.3.2.3 離心

以3500 r/min，離心10 min。

1.3.2.4 調pH

用0.1 mol/L的鹽酸和0.5 mol/L的氫氧化鈉調pH。

1.3.2.5 干燥

選擇40 ℃烘干，以防止高溫破壞苦蕎提取物。

1.3.3 苦蕎中蕎麥蛋白和黃酮類化合物微波同步提取條件優化方法

1.3.3.1 粉碎粒度對苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

分別在粉碎粒度為40，60，80，100目，液料比為30∶1 (mL/g)，pH為9，微波時間為1 min，微波功率為360 W條件下進行微波同步提取，計算得率。

1.3.3.2 液料比對苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

分別在液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1(mL/g)，粉碎粒度為80目，時間為1 min，pH為9，微波功率為360 W條件下進行微波同步提取，計算得率。

1.3.3.3 pH對苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

分別選取pH值7，8，9，10，11，粉碎粒度為80目，微波功率為360 W，液料比為30∶1 (mL/g)，時間為1 min條件下進行微波同步提取，計算得率。

1.3.3.4 微波時間對苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

分別在微波時間0.5，1，1.5，2，2.5，3.0，3.5，4.0 min，粉碎粒度80目，微波功率為360 W，液料比為30∶1 (mL/g)條件下進行微波同步提取，計算得率。

1.3.3.5 微波功率對苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

分別在微波功率為180，360，540，720，900 W，粉碎粒度為80目，液料比為30∶1(mL/g)，微波時間為1 min條件下進行微波同步提取，計算得率。

1.3.4 總黃酮的測定

準確稱取蘆丁標準品20 mg，用60%的乙醇溶液溶解并定容至100 mL，配成濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標準溶液。分別取蘆丁標準溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL置于25 mL具塞比色管中，加水至6 mL，先加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻放置6 min，然后加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液，混勻放置6 min，再加入10 mL 4% 的氫氧化鈉溶液，最后用蒸餾水定容至刻度，搖勻放置15 min。以60%乙醇作空白，在510 nm波長下測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線[14]。

1.3.5 提取液中蕎麥蛋白的測定[15]

1.3.5.1 考馬斯亮藍G250溶液的制備

準確稱取考馬斯亮藍G250標準品100.00 mg于燒杯中，先加入95%的乙醇50 mL，再加入85%的H3PO4溶液100 mL，最后用蒸溜水定容至1000 mL，常溫避光保存備用。

1.3.5.2 牛血清蛋白對照品溶液的制備

準確稱取牛血清蛋白標準品100.00 mg，用適量蒸溜水溶解并定容至1000 mL，得到濃度為100 mg/L的牛血清蛋白標準溶液，置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.5.3 標準曲線的繪制

取6支試管依次編號，分別向其中加入濃度為100 mg/L的牛血清蛋白標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，均用蒸溜水補至1.0 mL，此時6支試管內牛血清蛋白的濃度依次為0，20，40，60，80，100 mg/L，分別加入考馬斯亮藍G250溶液5 mL，振蕩搖勻，室溫下充分反應5 min后，在波長為595 nm處測吸光度。最后，以牛血清蛋白溶液濃度為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。

2 結果

2.1 標準曲線的繪制

2.1.1 黃酮類化合物標準曲線的繪制

圖1 黃酮類化合物標準曲線Fig.1 Standard curve of flavonoids compounds

由圖1可知，蘆丁濃度與吸光度之間的回歸方程為：y=12.585x-0.006，R2=0.9992，根據回歸方程計算總黃酮得率。

2.1.2 苦蕎蛋白標準曲線的繪制

圖2 苦蕎蛋白標準曲線Fig.2 Standard curve of tartary buckwheat protein

由圖2可知，牛血清蛋白濃度與吸光度之間的回歸方程為：y=5.2957x+0.004，R2=0.9993，根據回歸方程計算蛋白得率。

2.2 苦蕎中蛋白和黃酮微波同步提取條件的選擇

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 粉碎粒度對苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

圖3 粉碎粒度對苦蕎蛋白和黃酮得率的影響Fig.3 Effect of particle size on the yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

由圖3可知，隨著粉碎粒度的減小，苦蕎蛋白和黃酮類化合物呈明顯的增加趨勢，粉碎粒度為80目時達到最大值，隨著粉碎粒度的繼續減小，兩者得率逐漸降低。因此，選擇80目的粉碎粒度為最佳微波同步提取條件。

2.2.1.2 液料比對苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

圖4 液料比對苦蕎蛋白和黃酮得率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

由圖4可知，當液料比為30∶1(mL/g) 時，苦蕎蛋白和黃酮類化合物得率達到最大，表明提取液體積的增加有助于蛋白和黃酮類化合物的溶出。但隨著液料比的增大，得率反而下降，這是由于物料過多，使得原料易被壓實，從而減少了原料顆粒間的孔隙，不利于原料與溶劑之間的充分接觸。此外，液料比的過大會使一些其他成分慢慢地被溶解出來，導致可溶性蛋白的提取量急劇下降[16]。因此，選擇液料比為 30∶1 (mL/g)。

2.2.1.3 pH對苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

圖5 pH對苦蕎蛋白和黃酮得率的影響Fig.5 Effect of pH on the yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

由圖5可知，隨著pH的增大，苦蕎蛋白得率先上升后下降再上升。pH為9時達到最大值，這可能是因為過大的pH值導致蛋白質內部因靜電排斥而造成分子伸展，從而使蛋白質變性沉淀，得率降低[17]。黃酮類物質隨著pH的增大呈現升高的趨勢。雖然在較大pH條件下黃酮具有較高的得率，但蕎麥蛋白會發生變性，且有較多的雜質溶出。綜合考慮，選擇pH 9為最佳微波同步提取條件。

2.2.1.4 微波時間對苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

圖6 微波時間對苦蕎蛋白和黃酮得率的影響Fig.6 Effect of microwave time on the yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

由圖6可知，在0.5～4.0 min區間，隨著時間的延長，苦蕎蛋白和黃酮類物質得率逐漸升高，當時間達到 1 min 時，二者的得率同時達到最大，隨著時間的繼續延長得率呈下降趨勢。這是由于溶劑和溶質間達到相對飽和的平衡狀態需要一定的時間，在短時間內細胞膜的破碎作用比較大，溶出物較多，得率上升較快[18]。而且適當延長微波時間有利于目標產物的溶出，但當達到平衡狀態后，繼續延長時間反而會導致目標產物降解，得率下降。故選擇最佳同步提取條件為1 min。

2.2.1.5 微波功率對苦蕎蛋白和黃酮類化合物同步提取的影響

圖7 微波功率對苦蕎蛋白和黃酮得率的影響Fig.7 Effect of microwave power on the yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

由圖7可知，在功率為180～900 W區間，隨著功率的增大，溶解能力增強，苦蕎蛋白和黃酮的得率逐漸升高，當功率達到360 W時，蛋白和黃酮的得率達到最大，隨著功率的繼續增大得率有所下降?？赡苁且驗槲⒉ㄌ幚頃茐募毎?，加快蛋白和黃酮類物質的溶出，故得率增加，但提取過程中會產生較大的熱量，過高的溫度致使過多的雜質溶出，且易造成經濟損失。故選擇微波功率為360 W最合適。

2.2.2 響應面優化試驗

根據單因素試驗，選擇粉碎粒度(A)、液料比(B)、微波時間(C)，以苦蕎蛋白和黃酮類物質得率為考察指標進行響應面優化設計同步提取苦蕎中蛋白和黃酮類物質，其因素水平編碼表見表2，試驗結果見表3。

表2 因素水平編碼表Table 2 Coding table of factors and levels

表3 苦蕎蛋白和黃酮得率響應面設計及結果Table 3 Response surface design and results of yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

2.2.3 模型方程的建立與顯著性檢驗

應用Design-Expert 8.0.6 軟件對表4及表5中的結果進行二次回歸分析，得到苦蕎蛋白和黃酮類化合物的二次回歸方程模型。蛋白得率=8.16-0.76A+0.60B+0.21C-0.23AB-0.26AC+0.12BC-1.32A2-0.98B2-1.12C2。黃酮得率=1.44-0.081A+0.064B+0.073C-0.045AB+0.042AC-0.057BC-0.32A2-0.34B2-0.28C2。

表4 苦蕎蛋白的回歸模型方差分析表Table 4 Regression model variance analysis of tartary buckwheat protein

續 表

注：“*”為p<0.05，差異顯著；“**”為p<0.01，差異極顯著。

表5 苦蕎黃酮的回歸模型方差分析表Table 5 Regression model analysis variance of tartary buckwheat flavonoids

注：“*”為p<0.05，差異顯著；“**”為p<0.01，差異極顯著。

二者的模型 P都小于0.01，則模型極顯著，說明預測值與試驗值具有良好的擬合性。其模型失擬項的P值分別為0.0585，0.7939，均大于0.05，表明模型的失擬項不顯著，建立的回歸方程能較好地確定微波輔助提取的最佳工藝條件。由表4可知，對苦蕎蛋白得率影響極顯著的是A、B、A2、B2、C2，顯著的是C、AC；由表5可知，對苦蕎黃酮類化合物得率影響極顯著的是A、C、A2、B2、C2，顯著的是B。在各影響因素中，對苦蕎蛋白得率的影響順序為粉碎粒度>液料比>微波時間；對苦蕎黃酮得率的影響順序為微波時間>粉碎粒度>液料比。平方項對蛋白和黃酮的得率影響都比較大，說明影響值與試驗因素之間并不是簡單的線性關系。

2.2.4 響應面分析

依照Box-Behnken中心組合設計原理和試驗數據得出的各因素間的交互作用見圖8和圖9。

圖8 各因素間的交互作用對微波提取蛋白得率的影響Fig.8 Effect of the interaction of various factors on the yield of protein extracted by microwave

圖9 各因素間的交互作用對微波提取黃酮得率的影響Fig.9 Effect of the interaction of various factors on the yield of flavonoids extracted by microwave

等高線和三維曲面圖能夠更加直觀地反映各因素之間的交互作用。通過分析可以預測出微波輔助法同步提取苦蕎中蛋白和黃酮的最優工藝參數為：粉碎粒度75.24目，液料比32.15∶1 (mL/g)，微波時間1.06 min，苦蕎蛋白得率為8.39%，黃酮得率為1.44%。考慮到實際操作的可行性，將各因素條件修正為：粉碎粒度80目；液料比32∶1(mL/g)；微波時間63s；微波功率360W；pH9。

2.2.5 驗證試驗

在修正后的條件下進行驗證性試驗，進行3次試驗后計算平均值，苦蕎蛋白和黃酮類物質的得率分別為8.29%和1.38%，與理論預測值的吻合性比較相對良好，表明模型合理，可以進行苦蕎蛋白和黃酮類物質的同步提取。

3 結論

研究表明微波輔助法同步提取苦蕎中蕎麥蛋白和黃酮類化合物的最佳工藝條件為：粉碎粒度80目，液料比32∶1(mL/g)，微波時間63 s，微波功率360 W，pH 9，在此條件下苦蕎中蛋白和黃酮的得率分別達到8.29%和1.38%。為蛋白和黃酮類化合物的同步提取研究提供了一定的理論依據。