甲酸對AOB 及NOB 關鍵酶活性影響的MOE 模擬

李娜 林星月 鄧一興 李國德 武士威 胡筱敏 代嵐

（1. 沈陽師范大學實驗教學中心，遼寧沈陽 110034；2. 沈陽師范大學科研處，遼寧沈陽 110034；3. 東北大學資源與土木工程學院，遼寧沈陽 110004；4. 沈陽師范大學糧食學院，遼寧沈陽 110034）

1 引言

短程硝化在降低污水處理費用的同時使低碳氮比廢水的高效脫氮成為可能，但短程硝化反硝化的影響因素有很多，實際應用中單一因素的控制很難實現亞硝氮的積累，增加了短程硝化反硝化實現的難度。甲酸為揮發性脂肪酸，目前已有研究者研究了揮發性脂肪酸對硝化反應的抑制作用，但大多是將揮發性脂肪酸作為碳源進行研究［1-2］，在污水處理過程中，通過投加甲酸控制短程硝化的研究未見報道。揮發性脂肪酸作為碳源時對硝化反應抑制作用的研究［1-2］表明，甲酸作為控制短程硝化的抑制劑原理上分析是可行的，但尚未有相關研究。本研究采用MOE（分子操作環境）作指導，分析甲酸對AOB（氨氧化菌）及NOB（亞硝酸鹽氧化菌）關鍵酶活性的影響，探索甲酸對短程硝化控制的可行性。

2 MOE 模擬方法

MOE 是由Chemical Computing Group（化學計算集團公司）公司推出的，其可應用于生物信息學、高通量研究、蛋白質模擬、分子模擬等領域。通過MOE 進行分子對接可直觀地了解蛋白質與小分子的相互作用［3］。甲酸的2D分子結構通過ChemDraw 2004（CS Chemoffice 2004）制得，然后導入MOE 軟件得到甲酸的3D 結構。AOB 氨單加氧酶（AMO，PDB ID：4O65），AOB 羥胺氧化還原酶（HAO，PDB ID：4N4N），反硝化菌的亞硝酸鹽還原酶（Nir-Cu，PDB ID：1sjm）的X 射線晶體結構從Research Collaboratory for Structural Bioinformatics（RCSB，結構生物信息學研究聯合實驗室）的Protein Data Bank（PDB）數據庫中獲得［4］。NOB 氧化還原酶（NXRβ）的3D 模型由SWISS-MODEL（蛋白質結構預測）模擬得到［5］。

3 結果與討論

3.1 甲酸與4 種關鍵酶的對接結果分析

AMO 和HAO 幾乎是所有AOB 的關鍵酶，主導了整個細菌的代謝過程，Nir-Cu 是反硝化菌的關鍵酶，主導了反硝化菌的代謝過程，可從RCSB 的PDB數據庫中獲得它們的X 射線晶體結構。NXR 是NOB的關鍵酶，但是目前其X 射線的晶體結構還未得到，因β亞基是它的主要功能結構，所以通過SWISSMODEL 模擬了它的β 結構。甲酸的2D 分子結構通過ChemDraw 2004（CS Chemoffice 2004）制得，然后導入MOE 軟件得到甲酸的3D 結構。

甲酸與4 種關鍵酶的對接情況如圖1 所示，關鍵酶只顯示氨基酸骨架結構。選取甲酸與4 種酶對接時結合鍵最為牢固的情況進行比對，從模擬角度看，甲酸對AOB 和NOB 的影響是促進作用的強弱不同，其對AOB 促進作用最強，其次是反硝化菌，對NOB 的促進作用最弱。由此推斷有甲酸存在的情況下，AOB 與反硝化菌可能會逐漸增長并成為優勢菌種。這一結論還需進一步實驗進行驗證。

圖1 甲酸與4 種關鍵酶的對接情況

3.2 甲酸對微生物群落結構的影響

為進一步驗證MOE 模擬結果，在運行穩定的MBBR 中進行投加甲酸控制短程硝化實驗研究，投加甲酸30 d 裝置中三氮濃度變化如圖2 所示。

圖2 投加甲酸時三氮濃度隨時間的變化情況

由圖2 可以看出，投加甲酸后出水亞硝氮濃度逐漸增加，10 d 后亞硝氮積累趨于穩定。穩定運行后亞硝氮積累率最高達到89.71%，平均亞硝氮積累率由23.71%增加到76.03%。氨氮去除率在投加甲酸初期有所下降，運行穩定后平均氨氮去除率為99.31%，運行穩定后甲酸的投加對氨氮的去除沒有影響。

對未投加甲酸和投加甲酸20 d 的微生物進行高通量測序分析，結果如圖3 所示。從微生物群落分析結果可以看出，投加甲酸20 d 的微生物高通量測序分析中出現了亞硝化菌nitrosomonas 以及有反硝化作用的thermomonas［6］，這一結果與MOE 模擬分析結果一致。

圖3 樣品微生物群落結構分析

4 結論

甲酸與AMO，HAO，NXR 及Nir 的MOE 分子模擬結果表明，有甲酸存在的情況下，AOB 與反硝化菌會逐漸增長并成為優勢菌種，這一結果與投加甲酸后反應器中微生物群落結構分析結果一致。