LC/MS/MS法測定柚皮苷在大鼠血漿中的濃度及其藥代動力學研究

郭俐麟　唐冰雯

摘? 要：目的：建立LC/MS/MS法測定大鼠血漿中柚皮苷濃度，并考查其藥代動力學特征。方法：采用Sepax HP-C₁₈色譜柱：（100 mm×2.1 mm，5 μm），以甲醇-2 mmol·L^-1醋酸銨溶液（65：35）為流動相;流速：0.3 ml·min^-1。離子源為ESI源，正離子模式進行檢測。結果：大鼠靜脈注射給藥柚皮苷后，血漿中可以迅速檢測到大量的柚皮苷與少量的代謝產物柚皮素。柚皮苷的T_max為0.083 h，達峰濃度C_max為56583.33 ng·ml^-1;柚皮素葡萄糖醛酸結合物的T_max為12 h，達峰濃度C_max為653.68 ng·ml^-1。結論：該方法選擇性強、靈敏度好，可用于測定大鼠生物樣本中柚皮苷及其代謝產物柚皮素的濃度。

關鍵詞：柚皮苷;柚皮素;LC/MS/MS;藥代動力學

Abstract Objective：To establish a LC/MS/MS method for the determination and pharmacokinetic study of naringin in rats plasma.Method：A Sepax HP-C_18? column was used，with the mobile phase of methanol-2 mmol·L^-1 ammonium acetate（65：35）.The flow rate：0.3 ml·min^-1.The determination used electrospray ionization mass spectrometry with positive ionization mode.Results：After intravenous administration the naringin，in blood，we can rapidly determine many naringin and a little naringenin in vivo.Tmax of? naringin is 0.083 h，Cmax is 56583.33 ng·ml^-1;Tmax of naringenin glucuronides is 12 h，Cmax is 653.68 ng·ml^-1.Conclution：The method is selective and sensitive and can be used to determine the concentration of naringin and its metabolite（naringenin）.

Key words：naringin;naringenin;LC/MS/MS;pharmacokinetics

柚皮苷屬于二氫黃酮苷，主要存在于柚、葡萄柚和酸橙及其變種的果皮及果實中，研究表明其具有抗氧化^[1][2]、抑菌^[3]、抗癌^[4][5]等作用，柚皮苷作為一類重要的中藥化學成分，由于它的功效顯著，具有良好的開發前景，對其的研究也愈來愈熱，對它的吸收和代謝等的藥代動力學研究必將愈加深入，藥代動力學方法學研究是藥代動力學研究的基石，然而柚皮苷在藥代動力學及其方法學方面的研究報道較少^[6]，多數采用高效液相色譜法進行研究，其靈敏度不夠高，分析時間長。采用LC/MS/MS法對其進行定性和定量分析，可提高靈敏度，縮短分析時間，提高了工作效率，這對全面進行柚皮苷藥代動力學研究發揮了厚積薄發的作用，進而對于了解柚皮苷的作用機制，指導臨床合理用藥、優選用藥方案、指導柚皮苷劑型改革和新藥研究設計都具有重要的意義。

1 儀器、試藥

1.1 儀器

美國應用生物系統公司（AB）API 3000 型號LC/MS/MS 液質聯用串聯四極桿質譜儀，包括電噴霧離子化源（ESI），大氣壓化學離子化源（APCI），島津Shimadzu LC-10 AD_VP 雙高壓梯度洗脫裝置、DGM-12 AM 在線脫氣機，并配有直接進樣用針泵及1 ml進樣器以及AB公司ANALYST 1.3 數據處理軟件;Shimadzu ΜV-2501 PC 紫外分光光度計、日本島津Shimadzu LC-Vp series 高效液相儀系統;上海安亭科學儀器廠TGL-16G 離心機;組織勻漿器;上海滬西分析儀器廠WH-3 渦旋混合儀;分析天平（Mettler Toledo，AG 135）

1.2 試藥

對照品柚皮苷（批號：110722-200708，中國生物制品檢定所）;對照品柚皮素（批號：09020121，上海同田生物技術有限公司）;橙皮苷（批號：110721-200512，中國生物制品檢定所）;

甲醇（色譜純，美國Fisher公司）;醋酸銨（色譜純，美國TEDIA公司）;純化水;乙酸乙酯（分析純）

2 動物與給藥方式

SD 大鼠（SPF級，動物合格證號為SCXK（粵）2003-0002，粵監證字2006A015）20只，雌雄各半，體重300±20 g。SD 大鼠10只，分為2組，實驗前一天禁食12 h，自由飲水，按45mg/kg劑量給藥，靜脈注射給藥柚皮苷原料，于預定的時間點（0 min，5 min，10 min，15 min，30 min，35 min，45 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h）大鼠眼眶取血。

3 檢測條件

3.1 色譜條件 色譜柱：Sepax HP-C₁₈（100 mm×2.1 mm，5 μm），預柱：菲羅門;流動相：甲醇：2mmol·L^-1醋酸銨（65：35）;流速：0.3 ml·min^-1;柱溫：室溫;進樣體積：20 μl。

3.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子化源（ESI）;掃描方式：正離子多反應離子監測;鞘氣，碰撞氣，輔助氣均為氮氣;解離電壓：58 V;聚焦電壓：380 V;入口電壓：26 V;碰撞池入口電壓：8 V;電噴霧電壓：5000 V;輔助氣溫度：360 ℃;霧化氣：8;門簾氣：10;碰撞氣：7;多反應離子監測：柚皮苷：581.3/273.3，碰撞能8 V，掃描時間200 ms;柚皮素：273.4/153.1，碰撞能6 V，掃描時間200 ms;橙皮苷（內標）：611.1/303.3，碰撞能：12 V，掃描時間：200 ms。采用DAS 2.0藥代動力學軟件，用統計距計算藥物代謝動力學參數。

4 方法和結果

4.1 儲備液的配制

柚皮苷標準儲備液：稱取105 ℃干燥至恒重的柚皮苷對照品約10 mg，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成濃度為200 μg·ml^-1標準儲備液。

柚皮素標準儲備液：稱取105 ℃干燥至恒重的柚皮素對照品約10 mg，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成濃度為200 μg·ml^-1的標準儲備液。

內標標準儲備液：稱取橙皮苷對照品10 mg，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為200 μg·ml^-1的溶液作標準儲備液。

4.2 生物樣品的制備

4.2.1 血漿樣品的制備

大鼠眼眶取血，置1.5 ml肝素處理的塑料離心管中，6000 rpm離心10 min;分取血漿，置冰箱中-20℃保存;供測定用。

4.3 生物樣品的處理方法

4.3.1 血漿或組織樣品處理方法

取動物血樣100 μl，置1.5 ml離心管中，加入5 μg·ml^-1內標橙皮苷對照品溶液10 μl，渦旋混合儀上渦旋30s，加入700 μl乙酸乙酯進行萃取，渦旋2 min，離心機上9000 r/m離心10 min，取上清液，室溫下揮干溶劑。殘渣用流動相（甲醇：2mmol醋酸銨=65：35）100 μl重溶，進樣20 μl。

4.3.2 酶解的處理方法

取血樣100 μl，置1.5 ml離心管中，加入10 μl酶（β-葡萄糖苷酸酶），37 ℃水浴1小時，取出，加入內標溶液10 μl，其余操作同4.3.1。

4.4 方法學考察

4.4.1 方法專屬性

按生物樣品預處理方法進行考察，考察6只不同動物個體空白樣本，比較空白血漿、加入內標和對照品的血漿以及給藥后的某一時間點血樣的色譜圖，確定方法的專屬性。結果見圖1，結果表明：空白血漿不干擾待測物及內標的測定。

4.4.2? 靈敏度考察

將濃度為100 ng·ml^-1柚皮苷標準溶液、柚皮素標準溶液進行稀釋，按4.3.1分別制成血漿樣品進行液質檢測，當峰高為噪音的3倍（S/N=3），得到柚皮苷檢測限為0.5 ng·ml^-1。柚皮素檢測限為0.5 ng·ml^-1。

4.4.3? 標準曲線與線性范圍

按4.3.1項下操作，制成血漿中柚皮苷和柚皮素濃度分別為：10 ng·ml^-1、50 ng·ml^-1、100 ng·ml^-1、500 ng·ml^-1、1000 ng·ml^-1、2500 ng·ml^-1的血漿樣品。用液質聯用儀正離子MRM方式進行檢測，每個樣品進樣20μl。以柚皮苷與內標的峰面積比和血漿樣品中柚皮苷濃度進行線性回歸，即得標準曲線方程和線性范圍，標準曲線方程為：Y=0.0016X+0.00672（r=0.9992），以柚皮素與內標的峰面積比和血漿樣品中柚皮素濃度進行線性回歸，即得標準曲線方程和線性范圍，標準曲線方程為：Y=0.0015X+0.0083（r=0.9948），柚皮苷在10 ng·ml^-1～2500 ng·ml^-1濃度范圍內線性關系良好，柚皮素在10 ng·ml^-1～2500 ng·ml^-1濃度范圍內線性關系良好。

4.4.4? 精密度、準確度試驗

按4.3.1項下操作，制備柚皮苷（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）和柚皮素（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）高、中、低三個濃度生物樣品，用液質檢測（n=5），求得測定濃度值與平均值，計算RSD%，為日內精密度，每天進樣一次，共三天，計算RSD%，為日間精密度。柚皮苷日內精密度RSD為4.76%、8.84%、5.99%，柚皮苷日間精密度RSD為2.88%、0.70%、4.37%;柚皮素日內精密度RSD為3.48%、6.80%、2.12%，柚皮素日間精密度RSD為5.23%、3.72%、3.51%。結果表明，柚皮苷、柚皮素日內和日間精密度良好。

4.4.5提取回收率

按4.3.1項下操作，制備柚皮苷（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）和柚皮素（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）高、中、低三個濃度生物樣品，每個濃度5個樣本。量取20 μl，注入LC/MS/MS，記錄質譜圖。

另取1.5 ml塑料離心管，分別加入相應的柚皮苷和柚皮素標準溶液用流動相稀釋，制成相應濃度的標準溶液樣品，記錄質譜圖。按公式計算，分別求出柚皮苷和柚皮素提取回收率和RSD值。結果顯示柚皮苷高、中、低3個濃度提取回收率分別為40.2%、43.1%、41.6%，RSD為3.55%、4.62%、6.14%。柚皮素高、中、低3個濃度提取回收率分別為61.6%、64.2%、74.0%，RSD為3.01%、2.20%、7.96%。

4.4.6方法回收率試驗

按4.3.1項下操作，制備柚皮苷（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）和柚皮素（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）高、中、低三個濃度生物樣品，每個濃度5個樣本。用液質進行檢測，測得信號值代入回歸方程，求得測定值。以測得濃度與加入量比較，計算高、中、低3個濃度的方法回收率，結果見表1、表2：

4.4.7? 穩定性試驗

按4.3.1項下操作，制備濃度分別為20ng·ml^-1、800ng·ml^-1、2000ng·ml^-1的血漿樣品，考察室溫放置4 h，-20℃凍融2次（每次間隔24 h），-20℃放置10 d，20 d，30 d后，樣品處理后的穩定性（n=3），柚皮苷生物樣品室溫穩定性RSD為7.43%、5.52%、3.38%。柚皮素生物樣品室溫穩定性RSD為0.85%、1.15%、1.37。柚皮苷生物樣品凍融穩定性RSD為13.45%、8.54%、0.80%。柚皮素生物樣品凍融穩定性RSD為1.05%、2.85%、4.55%。柚皮苷在-20℃放置10 d，20 d，30 d的穩定性RSD為9.76%、5.68%、9.45%。柚皮素在-20℃放置10 d，20 d，30 d的穩定性RSD為9.63%、6.62%、6.77%。結果表明：含藥生物樣品于室溫放置4 h、于-20℃下反復凍融2次后、于-20℃放置30天穩定性良好。

4.4.7 血漿樣品測定

本試驗根據藥效試驗所用劑量，在安全、有效的劑量范圍內，設計了大鼠靜脈注射給藥柚皮苷 45 mg·kg^-1，于給藥后預定時間點取血，按4.3.1項下操作，制備血漿樣品并進行測定，測定結果用DAS 2.0軟件的統計距進行計算。結果見表3，表4，圖2。

結果表明，大鼠靜脈注射柚皮苷原料后，在大鼠體內迅速檢測到柚皮苷，其達峰時間T_max為5 min，達峰濃度C_max為56583.33 ng·ml^-1，達峰后血藥濃度迅速下降。可檢測到少量的游離和葡萄糖醛酸結合物形式存在的柚皮苷代謝產物柚皮素，其柚皮素結合物的達峰時間T_max為12 h，達峰濃度C_max為653.68ng·ml^-1。可見柚皮苷在大鼠體內可部分轉化為代謝產物柚皮素，且主要是以葡萄糖醛酸結合物形式存在。

5 討論

本研究在方法學考察中分別考察了甲醇和水、甲醇和0.1%甲酸、甲醇和醋酸銨的混合溶液等幾種流動相，結果表明流動相為甲醇：醋酸銨（2 mmol·L^-1）=65：35時，柚皮苷、柚皮素在液質上可達到基線分離，且在此條件下離子對較為穩定，信號強度較高，峰形較好。

研究表明乙酸乙酯對黃酮類化合物的提取較理想，柚皮苷和柚皮素屬于二氫黃酮苷，本研究根據二者的理化性質，選擇乙酸乙酯作提取溶劑，并對文獻報道的方法進行了改進，將多次提取改為單次大體積提取，此法簡單易行，提取率穩定，能滿足體內低濃度藥物的測定和藥代動力學研究。

本研究曾使用了甲醇蛋白沉淀法，發生信號抑制，無離子對信號，基質干擾嚴重。還嘗試了乙酸乙酯提取前加入飽和NaCO₃，飽和NH₄Ac，0.1 mol·ml^-1HCl進行鹽析處理，使用乙酸乙酯：正丁醇（1：1），乙酸乙酯：正丁醇（1：2），乙酸乙酯：正丁醇（95：5），乙酸乙酯：異丙醇（95：5）混合溶劑進行提取，均未得到改善提取率的效果，與其它樣品前處理方法（如：蛋白沉淀法等）相比，該液-液提取法給LC/MS/MS分析帶來的基質效應（matrix effects）干擾相對較少。

從藥時曲線可以看出，靜脈注射柚皮苷原料后在大鼠體內并非大部分轉化為柚皮素，大部分仍然以柚皮苷的形式存在。靜脈注射柚皮苷原料后，柚皮苷的血藥濃度5 min達峰，消除很快，而代謝產物柚皮素主要是以葡糖醛酸結合物形式存在，幾乎測不到游離的柚皮素，柚皮素葡萄糖醛酸結合物的血藥濃度12 h達峰。

參考文獻

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第一作者簡介：郭俐麟，碩士研究生，從事藥物分析研究。