鳥嘌呤四鏈體在生化分析中的應用進展

劉卓靚 陶呈安 王建方

摘?要?鳥嘌呤四鏈體（G-四鏈體）是一種特殊的核酸二級結構，它可與高鐵血紅素結合，形成具有過氧化物酶活性的核酶; 也可增強特殊結構染料的熒光強度。G-四鏈體作為功能核酸中的一種，具有性質穩定、特異性好、功能多樣等特點，被廣泛應用于各種生化分析中。本文對近年來G-四鏈體在生化分析中的研究和應用進展進行了評述，對其應用前景進行了展望。

關鍵詞?G-四鏈體; 功能核酸; 核酶; 生化分析; 評述

1?引 言

隨著現代醫學的發展，特定核酸、蛋白、酶等的檢測，已成為某些疾病的直接或間接診斷指標[1～3]。而傳統的檢測方法，如高效液相色譜法、聚合酶鏈式反應（PCR）、免疫印跡法、電泳法[4～6]都涉及專業人員操作以及大型儀器的使用，存在檢測時間長、操作復雜、檢測靈敏度不高等問題。而比色法及熒光法[7，8]作為儀器分析中的經典方法，重復性好、操作簡單，易于試劑盒的開發。比色法或熒光法中如何高效穩定輸出信號的報告分子是分析方法的研究熱點。功能核酸鳥嘌呤四鏈體（G-四鏈體）的特殊理化性質，如與高鐵血紅素結合生成具有過氧化物酶活性的核酶、增強特殊結構染料的熒光強度等，可靈活地實現信號的穩定輸出。利用G-四鏈體作為報告分子，與各種功能核酸或核酸信號放大方法聯用，可實現多種目標分子高特異性、高靈敏的檢測，為多種生化分析提供快速、簡便的檢測方法。

本文首先介紹了G-四鏈體的分類和功能，以及利用其與金屬離子作用引起的結構變化而導致性質的變化，結合特定染料或藥物分子的性質，與其它功能核酸聯用等，在小分子、蛋白質、酶、金屬離子、目標DNA或RNA檢測、細胞成像及癌癥治療等方面應用的研究進展進行了評述。

2?G-四鏈體簡介

2.1?G-四鏈體的分類

鳥嘌呤平面是由4個鳥嘌呤通過氫鍵構成的方形平面，G-四鏈體由幾個鳥嘌呤平面堆疊而成，其結構由處于平面之間的金屬離子形成穩定金字塔結構 [9]。中心穩定離子為一價或者二價金屬離子，其中K+是最常見的金屬離子，金屬離子的大小決定G-四鏈體結構的穩定性[10，11]。

根據形成G-四鏈體的DNA或RNA鏈的數目分類，由一條鏈形成四鏈體結構稱為分子內G-四鏈體，多條鏈構成的稱為分子間G-四鏈體。根據鏈的走向可分為3類：當四條鏈的方向均相同時，為平行結構; 當兩條鏈方向相同，另兩條鏈與其方向相反時，為反平行結構; 其它情況稱為混合平行結構（圖1）[12，13]。G-四鏈體的結構可通過圓二色譜測定。所有的G-四鏈體結構在210 nm處都有一個正的特征吸收峰。平行結構的G-四鏈體在240 nm處有一個負吸收峰，在260 nm附近有一個正吸收峰; 反平行結構的G-四鏈體在260 nm處有一個負吸收峰，在290 nm處有一個正吸收峰[14]。

G-四鏈體的結構主要取決于DNA或RNA的序列、核酸鏈的濃度和穩定離子的種類[15]。以穩定離子種類為例，Kong等[16]發現同樣的序列在K+或Na+條件下形成不同的結構，他們系統研究了以T為間隔的堿基序列（5′-G3TiG3TjG3TkG3-3′）。當T的總數目≤5時，在100 mmol/L的K+和Na+條件下均形成平行結構; 當T的總數目為6～7時，在K+存在下依然形成平行結構G-四鏈體; 而Na+穩定時折疊成混合平行結構。 Li等[17]發現，PW17在K+存在下形成平行結構G-四鏈體，而Pb2+條件下為反平行結構。

2.2?G-四鏈體的性質

2.2.1?G-四鏈體構成的模擬酶?具有酶催化活性的DNA或RNA稱為核酶（DNAzyme/RNAzyme）[18]。目前已發現具有切割或連接DNA/RNA、模擬過氧化物酶等活性的核酶[19～21]。G-四鏈體與輔因子高鐵血紅素（Hemin）結合形成具有過氧化物酶活性的核酶，可催化多種底物的氧化，包括ABTS、TMB、AmplexRed、魯米諾等。這種核酶是Travascio等[22]在篩選可特異結合N-甲基化卟啉IX的核酸適配體時發現的，而后進一步優化得到18個堿基的核酸適配體PS2.M。PS2.M形成的G-四鏈體與Hemin構成的核酶，其催化活性是Hemin單獨存在時的250倍[23]。此類核酶的催化反應機理與辣根過氧化物酶類似，G-四鏈體模擬辣根過氧化物酶中的組氨酸殘基為Hemin中的Fe提供一個軸向配體和一個疏水環境，有利于OO的異裂。G-四鏈體為Hemin提供一個平面結構，有利于氫的交換[24～26]。目前，對于此類核酶的活性調控主要有3種方法：（1）是改變G-四鏈體本身的序列，從而改變其拓撲結構來影響其性質; （2）是改變穩定中心離子，從而改變G-四鏈體的構型而改變Hemin的結合情況; （3）是在G-四鏈體的序列末端增加腺嘌呤，可將其活性提高至原有活性的4倍[24]。另外，還可加入ATP來穩定催化過程中產生的自由基，提高催化效率[27]。

2.2.2?G-四鏈體增強熒光的染料?G-四鏈體可結合一些特定的熒光染料，極大地增強染料自身的熒光強度， 例如卟啉衍生物、酞菁染料、結晶紫、三苯甲烷等染料。熒光增強的原理是G-四鏈體可為染料分子提供一個疏水環境，防止熒光分子的相互靠近導致的自淬滅現象。

結晶紫（Crystal violet， CV）是一種三苯甲烷染料，堆積在兩個鳥嘌呤平面之間，可區分平行和反平行G-四鏈體。反平行G-四鏈體的Loop環可結合CV使其不受溶劑的影響，使得熒光大大增強。而平行G-四鏈體側鏈的Loop環不能結合CV，使得CV的熒光增強明顯弱于結合反平行G-四鏈體的CV[16]。

硫磺素T（Thioflavin T， ThT）是一種水溶性染料，可特異性地識別并結合G-四鏈體，結合后其熒光強度可增大2500倍[28]。

（Z）-4-（3，5-difluoro-4-hydroxybenzylidene）-1，2-dimethyl-1H-imidazol-5（4H）-one（DFHBI）是一種可與RNA G-四鏈體結合并對其進行特異性識別的染料分子，結合后可模擬綠色熒光蛋白的熒光，用于細胞中的RNA成像[29]。在此基礎上，Feng等[30]報道了6種與紅色熒光蛋白生色團類似的染料分子，與G-四鏈體結合后發出的熒光光譜范圍幾乎覆蓋紅色熒光蛋白的發射光譜，并且有較高的熒光量子產率，以此可模擬紅色熒光蛋白，實現細胞內成像。

2.2.3?G-四鏈體降低電信號的電化學活性分子

亞甲基藍（Methylene blue，MB）是一種帶正電的芳香結構，是一種常用的電化學信號分子。Zhang等[31]研究發現，由于G平面的末端π-π堆疊效應，MB可競爭Hemin結合到G-四鏈體上，顯著減少擴散到電極表面的MB，從而使得電流下降。

3?G-四鏈體在生化分析中的應用

3.1?小分子與蛋白質的檢測

核酸適配體是經體外篩選，可高特異性和高親和力地識別并結合目標分子的單鏈DNA或RNA。以G-四鏈體為信號分子檢測小分子和蛋白質的傳感分析方法大多與核酸適配體單元聯用。如Willner研究組[32]將ATP的核酸適配體連接上一段G-四鏈體序列作為識別探針，另一條DNA與之部分雜交形成中間留有環狀結構的雙鏈結構。當ATP存在時，核酸適配體與ATP結合，識別探針從雙鏈上解離下來，釋放出的G-四鏈體與Hemin形成DNAzyme，催化底物反應（圖 2）。利用類似的設計，可實現可卡因、溶菌酶、細胞因子[33～35]等的檢測。在此類設計中，要求仔細篩選G-四鏈體和核酸適配體中被雙鏈結構封閉的堿基數目，使得在有目標分子條件下G-四鏈體可從雙鏈解離產生信號，而無目標分子時，G-四鏈體不會自動解離產生較高的背景信號。值得注意的，凝血酶有兩種長度分別為15及29個堿基的核酸適配體，且都可形成G-四鏈體結構。Li等[36]利用凝血酶的核酸適配體結合凝血酶后，可促進核酸適配體形成的G-四鏈體，并更好地結合Hemin以提高DNAzyme的催化活性，從而實現凝血酶的檢測。

3.2?酶活性的分析

酶是生命過程中不可或缺的一部分，各種疾病的發生都與酶活性的異常相關，因此酶活性的檢測是生化分析中的重要內容。以G-四鏈體為信號分子分析酶活性的報道中，檢測對象大多是以核酸為底物的酶。以下介紹幾種在疾病診斷、分子生物學中有重要意義的酶的檢測方法。

3.2.1?T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 PNK）?T4 PNK是一種雙功能酶，可移除3′磷酸基團以恢復3′羥基基團，也可實現5′磷酸化。Liu等[37]報道了一種基于G-四鏈體-DNAyzme比色檢測T4 PNK的方法。在該體系中，設計了兩條探針，一條是3′磷酸化的引物，一條是封閉有G-四鏈體序列的發夾探針。當T4 PNK存在時，引物的3′磷酸被去磷酸化，生成3′羥基，此時聚合酶可將引物延伸打開發夾，釋放G-四鏈體序列。該方法可檢測低至0.01 U/mL的T4 PNK。基于T4 PNK5′磷酸化活性，裴仁軍研究組[38]設計了一種裂分的G-四鏈體 DNAzyme檢測體系，實現最低濃度0.014 U/mL的T4 PNK的檢測。

3.2.2?核酸外切酶Ⅲ（Exonuclease Ⅲ，Exo Ⅲ）?Exo Ⅲ具有從3′-5′方向切割DNA的活性，在DNA復制等生理過程中有重要意義。Leung等[39]設計了發夾莖部含有G-四鏈體結構的探針用于分析ExoⅢ的活性。核酸內切酶Ⅲ從發夾莖部的3′端切斷，最后剩下的單鏈部分即為G-四鏈體，與CV結合后大大增加其熒光，以此來檢測核酸內切酶Ⅲ的活性（圖3A）。

3.2.3?DNA連接酶（DNA ligase）?DNA連接酶能催化DNA分子內或分子間毗鄰的5′磷酸基團和3′羥基基團形成磷酸二酯鍵， 將兩段相鄰的DNA拼合成一條完整的DNA鏈。He等[40]利用DNA連接前后對于發夾結構的改變，開發了基于G-四鏈體檢測DNA連接酶的方法（圖3B），最低可檢測0.2 U/mL的DNA連接酶。

3.2.4?DNA甲基化酶（DNA methyltransferase）?DNA甲基化酶能識別特定序列中的胞嘧啶或腺嘌呤，并將甲基共價連接到該堿基上，可調控基因表達。Li等[41]利用DNA甲基化酶識別發夾結構中的甲基化位點并對其甲基化，然后特異性切割酶DpnI識別被甲基化的堿基對其切斷，將G-四鏈體短片段釋放出來，可實現6 U/mL DNA甲基化酶的檢測。為進一步降低檢出限，引入聚合酶形成分子機器，通過識別甲基化后的片段DNA，進行多次的聚合及切割，可檢測更低濃度的甲基化酶，檢出限為0.25 U/mL。

3.2.5?焦磷酸酶（Pyrophosphatase， PPase）?PPase是作用于雙磷酸鍵上的酸酐水解酶， 可催化一分子焦磷酸鹽轉化為兩分子磷酸鹽離子。Wang等[42]根據Cu2+與焦磷酸配位形成Cu-Ppi復合物，而焦磷酸的水解產物磷酸不結合Cu2+，PPase作用后Cu2+從復合物上釋放出來，作為穩定G-四鏈體結構的中心離子，催化TMB與H2O2反應，實現了PPase的檢測，檢出限為0.0006 U/mL（圖3C）。

3.2.6?堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）?ALP可催化核酸分子脫去磷酸基團，從而轉變為羥基末端。Liu等[43]利用其能產生自由羥基末端的性質開發了一種以G-四鏈體為信號分子的電化學傳感器。ALP將雜交在電極上的DNA的磷酸基團除去形成羥基，再加入脫氧核糖末端轉移酶延伸得到長鏈的T序列，此時加入一段末端為polyA的G-四鏈體探針即能雜交到長鏈T上，G-四鏈體與Hemin形成DNAzyme催化電極表面Thi的氧化， 實現信號的輸出。此方法可實現最低濃度為0.00003 U/mL的ALP的檢測。

3.2.7?尿嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil -?DNA Glycocasylase， UDG）?UDG能特異性識別并除去DNA單鏈或雙鏈的尿嘧啶殘基，在細胞增殖過程中保持基因穩定性。Hu等[44]設計了一種免標記檢測UDG的新方法。該方法通過去除雙鏈DNA中的其中一條單鏈的4個尿嘧啶，形成AP位點使得雙鏈結構解離，釋放出的單鏈可折疊成G-四鏈體，增強甲基化卟啉（NMM）的熒光，實現UDG的檢測，檢出限為0.05 U/mL。另一種檢測UDG的方法涉及DNA修復酶切割酶的使用。利用UDG對U進行糖基化后，內切酶VI即可識別并切斷糖基化后的尿嘧啶產生3′羥基端，再經過聚合酶和限制性內切酶反復地聚合與切割，實現信號放大。此方法可實現最低濃度0.0001 U/mL UDG的檢測[45]。

3.2.8?聚合酶（Polymerase）?聚合酶能依據模板序列將dNTP聚合到引物上， 形成與模板互補的單鏈，對維持基因的穩定性有重要作用。Leung等[46]設計了一個帶有懸垂端的發夾分子，當有聚合酶存在時，較短的發夾一段作為延伸引物，另一段懸垂端作為模板進行擴增。對產物進行變性后，聚合產物鏈在K+存在下形成G-四鏈體，結合并增強Ir配合物的熒光，實現對聚合酶的檢測。

3.2.9?端粒酶（Telomerase）?端粒酶是一種核糖蛋白酶，能將端粒重復序列5′-GGGTTA-3′連接到染色體末端， 從而抑制癌細胞的無限增殖。Xiao等[47]利用端粒酶聚合生成的重復片段將發夾打開，釋放出完整的G-四鏈體，G-四鏈體與Hemin形成DNAzyme， 催化ABTS顯色， 以此來檢測端粒酶的活性。Li等[48]?開發了一個更簡單的方法，設計了一條含有3組3個鳥嘌呤重復單元的探針。此探針在結合Hemin后只有極低的催化活性。但當端粒酶存在時，端粒酶能在探針末端添加3個鳥嘌呤的重復單元，此時探針可形成G-四鏈體，高效催化ABTS的氧化，實現端粒酶的檢測。

3.2.10?脫氧核糖末端轉移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase， TdT）?TdT是一種特殊的DNA聚合酶，不需要模板，可催化DNA3′羥基端延伸，是一種被廣泛使用的工具酶。Nie的研究組[49，50]報道了在富含dGTP的底物池中，TdT合成的DNA長鏈可形成多個連續無固定序列的G-四鏈體，利用生成的G-四鏈體對ThT的熒光增強（圖3D）和CV的電化學信號放大作用，實現了TdT活性分析以及實時監測。

3.3?金屬離子的檢測

目前，金屬離子污染問題日趨嚴重，開發高效檢測金屬離子的方法，成為研究者關注的熱點。以G-四鏈體為信號分子的檢測方法可簡單、高效、便捷地檢測金屬離子，按其檢測原理可分為三類。

3.3.1?特異性穩定G-四鏈體的金屬離子?利用中心離子穩定的G-四鏈體構型不同而實現檢測。Li等[17]報道了一種基于G-四鏈體結構變化檢測Pb2+的方法。PS2.M在K+存在時折疊成平行結構的G-四鏈體，與Hemin結合后顯示較高的過氧化物酶活性。 在Pb2+存在時， PS2.M折疊成反平行的G-四鏈體，不利于與Hemin的結合，過氧化物酶活性下降。根據K+與Pb2+穩定的G-四鏈體的催化活性的差異，可實現二者的檢測（圖4A）。利用此原理，還可實現Tb3+[51]?、Ba2+[52]等的檢測。此外，還有一類特殊的例子，如利用Cu+能高效催化疊氮基團與炔基的Click反應，使得兩條裂分的DNA連接后能形成G-四鏈體結構，加入取代鏈后可將完整的G-四鏈體序列置換下來，實現CV的熒光增強，對Cu2+進行檢測，最低檢測濃度可達到65 nmol/L[53]。

3.3.2?與堿基作用的特定金屬離子?利用特定金屬離子與堿基的作用實現金屬離子檢測，如T-Hg2+-T， C-Ag+-C結構的形成。其中一類是基于金屬離子與堿基作用后抑制G-四鏈體的形成（Turn-off模式），另一類是促進G-四鏈體的形成（Turn-on模式）。Willner研究組報道了一種基于T-Hg2+-T的分子機器檢測Hg2+（圖4B）[54]。Li等[55]報道了基于C-Ag+-C作用下，拉近兩條裂分的G-四鏈體序列，構成完整G-四鏈體檢測Ag+，檢出限為2.5 nmol/L。

3.3.3?具有切割活性DNAzyme對應的金屬離子?自1994年第一例具有金屬離子切割活性的DNAzyme被報道以來，越來越多的金屬離子切割活性酶被發現。基于切割活性DNAzyme與G-四鏈體結構實現金屬離子檢測的方法，基本思路是利用發夾結構或者DNA的雙鏈結構封閉G-四鏈體信號區域，當有目標金屬離子存在時，對發夾結構或者雙鏈結構中的特定位置切割，通過釋放G-四鏈體序列，檢測目標離子。2009年， Yin等[56]報道了基于Cu2+切割型的DNAzyme檢測Cu2+的方法。當有目標離子Cu2+存在時，探針鏈自我切割， 釋放出自由的G-四鏈體部分，G-四鏈體部分與Hemin結合形成DNAzyme催化底物，實現Cu2+的檢測。通過這種方法可靈敏檢測Zn2+、UO2+2、Mg2+、Pb2+（圖4C）[57～59]，由于切割性核酶的特異性，使得該方法能特異性地實現金屬離子的檢測。

3.4?目標DNA/RNA檢測

許多疾病的發生與一些特定DNA或者RNA的異常表達有關，如p53、miRNA141，對這些DNA、RNA早期高靈敏檢測可實現疾病的早診斷、早治療。Weizmann等[60]報道了通過目標DNA打開發夾結構釋放G-四鏈體產生信號的方法檢測目標DNA; Deng等[61]利用目標DNA拉近裂分的G-四鏈體結構作為信號分子檢測DNA（圖5Ⅰ）。

對低豐度DNA、RNA，可通過信號放大方法實現檢測。信號放大的方式包括與其它納米材料聯用，或者引入核酸為底物的信號放大技術。以金納米顆粒聯合G-四鏈體放大檢測目標DNA為例，修飾在金電極上的捕獲探針與目標DNA雜交，此時加入修飾識別探針的金納米顆粒，此識別探針中間含有與目標互補序列以及G-四鏈體序列。由于金納米顆粒上修飾多個含有G-四鏈體的識別探針，實現信號的放大（圖5Ⅱ）[62]。以核酸為底物的信號放大方法主要有滾環擴增（Rolling circle amplification， RCA）、鏈置換擴增（Strand displacement amplification， SDA）、核酸內切酶輔助的放大（Nicking endonuclease signal amplification， NESA）、外切酶Ⅲ輔助信號放大方法等。這些放大方法以G-四鏈體為信號分子可實現超低濃度的核酸檢測[63～65]。Wang等[66]設計了一個含有3段與G-四鏈體互補以及與目標DNA互補序列的環狀DNA，以其為模板，以目標DNA為引物，進行滾環擴增。擴增產物中含有多個G-四鏈體結構，加入Hemin形成多個DNAzyme，催化底物魯米諾發光，實現目標DNA的檢測。前述的信號放大方法都需要酶的參與，而隨著DNA納米技術的發展，一種無酶鏈取代技術雜交鏈式反應（Hybridization chain reaction， HCR）被報道[67]。HCR中設計兩個發夾結構，通過觸發鏈（一般為目標DNA）打開其中一個發夾，被打開的發夾結構打開另一個發夾結構，兩者交替打開，形成一條長鏈的雙鏈DNA。

Shimron等[68]對兩個發夾結構的序列做了修改，使得在形成長的雙鏈DNA結構時，每個發夾末端有一段裂分G-四鏈體序列，相鄰兩個裂分G-四鏈體片段即可組成一個完整的G-四鏈體結構，作為信號輸出分子。

3.5?納米結構的形成與調控

平行的G-四鏈體結構可在特定金屬離子存在下形成長的、連續的納米結構，稱為G納米線。這類納米結構有良好的機械穩定性、抗熱、抗DNase I水解，以及獨特的光學和電化學性質，在結構納米技術中有潛在的應用價值[69]。Ren等[70]利用G納米線形成后其瑞利散射顯著增強，聯合Exo Ⅲ放大方法， 實現了Hg2+的靈敏檢測。He等[71]發現，G納米線表面負載CoIIPc后， 可高效、高選擇性地電催化CO2的還原。

利用G-四鏈體結構形成前后其結構的變化而引起鏈長度的變化，可作為納米結構的有效調控手段。Sannohe等[72]在兩段雙鏈結構中設置裂分的兩段G-四鏈體結構，當K+存在時，G-四鏈體形成，拉近兩段雙鏈，形成以G-四鏈體為節點的X型納米結構。G-四鏈體也可作為納米材料的距離調控手段。Sathya等[73]將ATP核酸適體的兩端分別連接碳點和銀納米顆粒，當沒有目標物ATP時，DNA呈松散狀態，碳點與銀納米顆粒相距較遠，沒有作用;而當目標物存在時，核酸適體結合其形成G-四鏈體結構，處于DNA兩端的碳點和銀納米顆粒距離被拉近， 形成有效的FRET對。

3.6?成像分析與癌癥治療

G-四鏈體可增強一些特異性染料的熒光，利用其特異性以及高倍數的熒光信號放大作用進行成像分析。G-四鏈體可特異性地結合TMpyP4，TMpyP4具有優良的光熱性質，可作為癌癥治療中的光動力治療分子。因此，這些特異性分子是G-四鏈體用于成像分析和癌癥治療的基礎。

細胞凋亡在細胞和機體生長調節過程中具有重要作用，細胞凋亡與多種疾?。ㄈ缢ネ诵约膊『桶┌Y）的發展有關。傳統評價細胞凋亡的方法包括DNA ladder實驗和TUNEL實驗。雖然這些方法可有效地指示細胞凋亡，但是具有消耗時間長、工作量大、多步的分離和清洗、低靈敏度、假陽性、高花費等缺點。為了解決這個問題，Nie研究組[74]基于TdT酶激活G-四鏈體合成，在單細胞水平對凋亡細胞進行免標記的原位生物成像（圖6A）。最近，該團隊及合作者針對常見的丙型肝炎病毒，以病毒RNA基因組序列中的G-四鏈體為靶點，設計合成熒光探針ThT-NE，建立了病毒RNA基因組活細胞熒光成像新方法[75]。該方法可實現非修飾或不需遺傳改造的活細胞中病毒RNA基因組分布信息獲取，監測整個病毒增殖過程，為病毒生物學、醫學診斷提供了新工具。

核仁素是涉及RNA轉錄、DNA復制和bcl-2穩定的多功能蛋白，很多癌癥細胞會高表達核仁素。AS1411是核仁素的核酸適配體，也可形成G-四鏈體結構。Shieh等[76]利用AS1411可特異結合并增強TMpyP4的熒光，實現對腫瘤細胞的識別與光動力治療（圖6B）。Liu等[77]在AS1411的兩端分別設計富含G-C的雙鏈結構，雙鏈結構可作為阿霉素的載體進行運送，因此可通過G-四鏈體實現兩種藥物的輸送，用于克服腫瘤細胞抗藥性的治療（圖6C）。而AS1411的識別作用只限于某些特定種類的腫瘤細胞，為了增加G-四鏈體作為藥物載體以及成像分子適用范圍，Tan研究組利用裂分的核酸適配體與G-四鏈體構建的雙功能核酸分子用于細胞成像與藥物輸送[78]?，以及合成同時具有核酸適配體和G-四鏈體序列的長鏈DNA探針實現腫瘤細胞的光動力治療以及近紅外成像[79]。以上研究中設計的治療探針一般只包含1個G-四鏈體結構，其輸送的光動力治療分子數目有限。Nie研究組[80]開發了一種基于TdT產生的G-四鏈體用于細胞成像和光動力治療的方法。以A549細胞的核酸適配體作為引物分子，TdT聚合生成含有多個G-四鏈體的長鏈DNA，加入染料ThT后，可實現目標細胞的成像檢測。而TMPyP4與G-四鏈體結構的親和力更強，可競爭ThT結合到G-四鏈體結構上，引入多個TMPyP4分子，可提高光動力治療的效率（圖6D）。前面所述的工作是通過增加G-四鏈體的數目從而增加光敏劑數量來提高治療效率。近日，Cheng等[81]開發了一種新型的光敏劑分子（TMPipEOPP）4+·4I，相比于傳統卟啉，實現了50 nm的紅移以及7.4倍的光吸收效率，極大地增強了單線態氧的產生以及光動力治療的效率。將 （TMPipEOPP）4+·4I與G-四鏈體結合作為光敏劑，并與MnO2結合，可實現高效的體內及體外光動力治療，并有望應用于臨床治療。

4?總結與展望

G-四鏈體作為一種功能核酸，具有性質穩定、特異性好、功能多樣等特點，被廣泛用于各種生化分析中。目前基于G-四鏈體開發的分析檢測方法包括比色法、熒光法、電化學、電化學發光等多種形式。由于G-四鏈體結構的特殊性， 其被用于細胞成像以及癌癥治療等方面的研究。G-四鏈體未來主要的發展趨勢可能有以下方面：（1）提高模擬過氧化物酶的活性。目前的研究結果表明G-四鏈體構成的核酶雖然可通過前文方法提高活性，但是對比蛋白酶的活性還是有很大差距。因此，提高核酶活性是重要的研究內容。（2）特異性識別的紅外染料的合成。隨著成像技術的發展，普通熒光成像面臨著高背景、易被光漂白等應用方面的限制。開發組織穿透能力高，結合G-四鏈體后能顯著增強熒光的染料，可拓展G-四鏈體在細胞成像方面的應用。（3）便攜式傳感器的開發與應用。目前，基于G-四鏈體的分析傳感方法多局限于實驗室應用， 開發便攜式（如試紙類、數顯類）直讀型便攜式商用傳感器將是未來的研究趨勢。

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Progress on Applications of G-quadruplex in Biochemical Analysis

LIU Zhuo-Liang1，2， TAO Cheng-An1， WANG Jian-Fang*1

1（Department of Biology and Chemistry， College of Liberal Arts and Sciences，

National University of Defense Technology， Changsha 410073， China）

2（State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，

College of Chemistry and Chemical Engineering， Hunan University， Changsha 410082， China）

Abstract?G-quadruplex is a special secondary structure of nucleic acid. G-quadruplex can bind with hemin to form DNAzyme with peroxidase activity， and also it can enhance the fluorescence intensity of some dyes. As one of the functional nucleic acids， G-quadruplex is widely used in various biochemical analyses due to its high stability， specificity and flexibility. The application of G-quadruplex in biochemical analysis and its application prospects are briefly introduced.

Keywords?G-quadruplex; Functional nucleic acid; DNAzyme/RNAzyme; Biochemical analysis; Review

（Received 13 July 2019; accepted 13 November 2019）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21705163）， the Natural Science Foundation of Hunan Province， China （No. 2019JJ50737）， the Research Project of the National University of Defense Technology （No. ZK18-03-39） and the Open Subject of State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics （No. 2017011）.