響應面法優化金槍魚復合冰衣液配比

余文暉,王金鋒,謝晶,4*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)3(上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，上海,201306)4(上海海洋大學，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，上海,201306)

金槍魚又名鮪魚、吞拿魚，是一種大洋暖水性洄游魚類，廣泛分布于太平洋、印度洋和大西洋低緯度水域[1]。其肉質鮮美、口感豐富，富含高蛋白低脂肪，具有極高的營養價值，是一種重要的商品食用魚[2]。金槍魚從捕獲到市場約需要30 d，因此金槍魚捕獲之后的保鮮技術和手段十分重要[3]。鍍冰衣保鮮是一種用于凍品貯藏的抗氧化、防止干耗的技術，魚體凍結后，迅速浸入冰衣液，然后取出，由于魚體表面過冷，在表面會形成晶瑩透亮的冰衣層，以隔絕空氣[4]。

冰衣液種類有多種，張越揚等[5]研究了酸性電解水冰衣對金槍魚的品質影響。結果表明，在-18 ℃的凍藏條件下，酸性電解水冰衣能夠顯著降低金槍魚中的細菌總數，減緩TVB-N值的上升。雷雨田等[6]將南美白對蝦分別鍍上水冰衣和茶多酚冰衣，在-18 ℃下凍藏24周，測定色差、蒸煮損失率和蛋白質的氧化程度，結果表明，茶多酚冰衣組的南美白對蝦色澤和蛋白質等指標都顯著優于水冰衣組和對照組，但蒸煮損失率指標稍差于水冰衣組。然而，采用單一冰衣液能夠顯著提升保鮮效果，但效果有限。根據柵欄技術原理，復合冰衣液具有協同效用，能夠發揮不同添加劑的保鮮效果，提升保鮮品質。

本文選用了迷迭香酸、乳酸鈉和竹葉抗氧化物3種保鮮劑進行復配，以持水力、色差和蛋白質綜合評分作為評價指標。在單一鍍冰衣對金槍魚保鮮影響的研究基礎上，通過響應面法，探究迷迭香酸、乳酸鈉和竹葉抗氧化物3種保鮮劑的最佳配比濃度，并測定相關指標對保鮮效果進行驗證，為金槍魚復合鍍冰衣保鮮的進一步研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

實驗采用捕撈后超低溫速凍后的大目金槍魚魚塊，大連晨洋科技發展有限公司；迷迭香酸(迷迭香提取物主要成分)，生工生物工程(上海)股份有限公司；乳酸鈉(食品級)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；竹葉抗氧化物(食品級)，浙江圣氏生物科技有限公司。

H-2050R 型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Kjeltec 8400 FOSS 全自動凱氏定氮儀，福斯分析儀器(蘇州)有限公司；CR-400型色彩色差計，日本柯尼卡美能達公司；UV-1102型紫外可見分光度計，上海天美儀器有限公司。

1.2 實驗方法

配制相應濃度的冰衣液，并加入質量分數為1%的增稠劑(羧甲基纖維素鈉)防止冰衣開裂。將大小均勻、超低溫凍藏的金槍魚魚塊，置于配制好的4 ℃冰衣液中，完全浸泡10～15 s進行鍍冰衣處理。在-18 ℃下凍藏30 d后，采用靜止水解凍，測定持水力、色差和鹽溶性蛋白含量。

1.2.1 單因素實驗

分別配制迷迭香酸冰衣液(質量分數分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)、乳酸鈉溶液(質量分數分別為1%、2%、3%、4%)、竹葉抗氧化物(質量分數分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)進行單一鍍冰衣實驗。

1.2.2 響應面法優化復合冰衣液配比

根據單因素實驗結果，以迷迭香酸冰衣液、乳酸鈉冰衣液、竹葉抗氧化物冰衣液質量分數3個因素為自變量，以持水力、色差值和鹽溶性蛋白含量總評分作為響應值，進行3因素3水平響應面實驗，并對實驗結果進行驗證。

1.2.3 保鮮結果驗證及分析

參照實驗結果，采用最佳配比復合冰衣液對金槍魚進行鍍冰衣處理，貯存6個月后測定持水力、蒸煮損失、色差、鹽溶性蛋白含量、TVB-N指標，與對照組進行對比分析，驗證保鮮效果。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 持水力

參照SAITO等[7]的方法并稍作修改，魚肉解凍后，用濾紙擦干表面的水分，稱取2.00 g左右的肉塊記為m1，用2層紙包好置于離心管中，5 000 r/min，4 ℃離心10 min，精確稱量離心后的肉塊質量記為m2，按公式(1)計算持水力。

(1)

1.2.4.2 色差

將解凍后的金槍魚魚肉切塊(規格1 cm×1 cm× 2 cm)，采用色差儀測定正反兩面色差值，每面測定2次，采用紅度值(a*)作為肉色變化的判定依據。每次實驗進行3次取平均值減小誤差。

1.2.4.3 鹽溶性蛋白質溶解度

參考NIU等[8]的方法測定。

1.2.4.4 蒸煮損失率

參照LI等[9]的方法并稍作修改，取1 cm×1 cm×1 cm的魚肉，稱重記為m2，放置于拉鏈袋中，85 ℃下水浴10 min后稱重記為m3，蒸煮損失率按照公式(2)計算：

(2)

1.2.4.5 TVB-N值的測定

參考GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》[10]中的分析方法進行測定。

1.2.5 評分

為了綜合評價金槍魚的新鮮程度，本文采用熵權法對持水力、色差和蛋白質計算權重，計算總評分。熵權法是一種客觀賦權法，利用信息熵計算各指標的權重，能夠正確反映各指標的相互重要程度。熵值法求指標值包含歸一化處理，因此不需要對數據進行歸一化預處理[11]。信息熵按照公式(3)計算，其中m表示指標數，n表示數據組數，Y表示指標的值，Ej表示該指標的信息熵。

(3)

式中

(4)

根據公式(5)計算各指標的權重Wj。

(5)

熵表示系統的無序程度，信息熵代表了信息的不確定度。指標的信息熵越小，該指標提供的信息量越大，在綜合評價中所起作用越大，計算權重越高，反之計算權重就越低。熵權法計算指標權重按照公式(3)～(5)依次進行計算。

1.3 數據處理方法

通過Design-Expert 10.0.7軟件進行分析，繪制響應曲面圖，得到復合冰衣液最佳濃度配比。其他圖形采用Origin Pro 2016繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

采用單一鍍冰衣的實驗方法，將金槍魚在-18 ℃貯藏30 d后，分別測定其持水力、色差和鹽溶性蛋白含量，并采用熵權法進行權重計算。金槍魚魚塊的持水力、色差和鹽溶性蛋白質含量的權重值分別為0.14、0.43和0.43,總評分如圖1所示。

圖1 單一鍍冰衣實驗結果Fig.1 Experimental results of single ice coat

迷迭香酸是迷迭香的主要提取物之一，通過清除自由基和金屬離子而具有一定的還原能力，具有抗氧化的作用[12]。在迷迭香酸鍍冰衣組別中，采用0.2%迷迭香酸鍍冰衣后的金槍魚鹽溶性蛋白含量最高，色差值和持水力也較好，總評分最高。SHI等[13]采用質量分數0.2%迷迭香提取物對蝦鍍冰衣凍藏保鮮，也具有最好的效果。乳酸鈉能夠抑制食物細菌生長，增強風味，延長貨架期，廣泛應用于食品工業[14]。采用3%乳酸鈉鍍冰衣后的金槍魚總評分與質量分數2%乳酸鈉差距不大，鹽溶性蛋白含量明顯高于質量分數2%的乳酸鈉冰衣組。竹葉抗氧化物是一種天然抗氧化劑，富含黃酮、內酯和酚酸類化合物，具有抗脂質氧化、抑菌的作用。隨著竹葉抗氧化物濃度的提高，鍍冰衣處理后的金槍魚，蛋白含量逐漸下降并趨于平穩，色差值差距不大，其中質量分數0.1%竹葉抗氧化物冰衣液評分最高。

2.2 采用響應面法優化金槍魚復合鍍冰衣配比

2.2.1 復合鍍冰衣配比實驗方案和因素水平

根據單因素實驗結果，利用Box-Behnken中心組合實驗設計原理，采用3因素3水平的響應面分析法設計實驗，實驗因素水平設計如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗設計因素和水平 單位：%

2.2.2 響應面分析

具體響應面實驗方案與結果如表2所示(由Design-Expert 10.0.7軟件生成)，實驗共17個實驗點，13～17為中心實驗點，中心實驗點的實驗誤差較小，均值是20.81，符合實驗要求。

對表2中的實驗數據進行多元回歸擬合后，得A迷迭香酸、B乳酸鈉和C竹葉抗氧化物濃度對總評分Y影響的二次多項回歸模型。

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 2 Box-Behnken experimental design scheme andresults

Y=20.82+0.25×A+0.72×B+0.42×C+

0.56×A×B+0.89×A×C-0.92×B×C-0.41A2-

1.10×B2-1.41×C2

(6)

2.3 模型顯著性檢驗

模型的方差分析結果如表3所示。總模型方差顯著(P<0.05)，模型擬合相關度97.71%。方差失擬項F值不顯著(P=0.1094>0.05)。該二次回歸模型與實際實驗擬合較好，適合復合冰衣液對金槍魚新鮮度影響的預測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Anovariance analysis of regression model

由表3中可以看出，迷迭香酸、乳酸鈉和竹葉抗氧化物質量分數對總評分影響均顯著(P<0.05),且任意2種因素對響應值存在顯著的交互作用(P<0.05)。各個因素對實驗結果的重要性由F值的檢驗判定，概率P值越小，顯著性越高[15]。由表3可知各個因素對金槍魚新鮮度的影響大小為：乳酸鈉>竹葉抗氧化物>迷迭香酸。

2.4 響應曲面分析及最佳復合冰衣液配比

利用Design-Expert 10.0.7軟件繪制的模型的三維響應值曲面可以直觀看出各因素對響應值的影響。

a-迷迭香酸和乳酸鈉;b-迷迭香酸和竹葉抗氧化物;c-乳酸鈉和竹葉抗氧化物圖2 迷迭香酸、乳酸鈉和竹葉抗氧化物交互作用對總評分的影響Fig.2 Response surface for the mutual influences of rosmarinic acid， sodium lactate and antioxidants in bamboo leaves on total score

迷迭香酸具有清除羥自由基的能力，濃度越高，清除能力越強[16]。由圖2-a可以看出，隨著迷迭香酸濃度的增加，總體評分上升，當乳酸鈉處在編碼范圍值(-1,0)時，兩者存在顯著的增效作用，當乳酸鈉處在編碼范圍值(0,1)時，總評分下降，這是因為乳酸鈉是一種弱酸鹽，高濃度的乳酸鈉會導致蛋白質變性[17]。竹葉抗氧化物富含黃酮類、內酯類和酚酸類化合物，能阻斷脂肪鏈自動氧化的鏈式反應，清除多種活性氧自由基，但竹葉抗氧化物顏色呈現黃色或棕黃色，濃度過高對色差造成一定影響，因此當竹葉抗氧化物濃度過高時也會造成評分下降。三維響應面圖在底面投影成等高線圖，可以反映出每2個因素對響應值變量造成的影響和交互作用的強弱。等高線圖呈橢圓形表示交互作用強，呈圓形表示交互作用較弱[18-19]。由圖2等高線可以看出乳酸鈉與迷迭香酸和竹葉抗氧化物結合具有很強的協同作用。通過對回歸方程的求導和分析，復合冰衣液的最佳成分配比是迷迭香(0.3%)、乳酸鈉(3.4%)和竹葉抗氧化物(0.12%)，此時金槍魚復合鍍冰衣的效果最好，預測評分為21.19分。

2.5 復合冰衣液對金槍魚鍍冰衣保鮮效果驗證

2.5.1 保水性評定結果

金槍魚魚肉中的水分含量與金槍魚蛋白質、色澤、質構等緊密相關，蒸煮損失和持水力的變化是衡量金槍魚新鮮度的重要指標[20-21]。表4顯示了金槍魚復合鍍冰衣和對照組貯藏6個月保水性的變化，可以看出復合鍍冰衣的金槍魚持水力下降遠遠慢于對照組。隨著貯藏時間延長，持水力下降趨勢變快，蒸煮損失的整體變化不大，這是由于凍藏過程中鹽溶性蛋白變性，破壞了蛋白質周圍疏水與親水結合鍵，導致蛋白質持水力的下降和魚肉保水性的喪失[22]。

表4 復合鍍冰衣對金槍魚保水性的影響 單位：%

2.5.2 鹽溶性蛋白含量的變化

鹽溶性蛋白作為金槍魚肌肉組織中主要成分，是評判肌肉品質好壞的重要指標[23-24]，如圖3所示。在凍藏過程中，由于冰晶的機械作用，導致肌原纖維蛋白破壞，鹽溶性蛋白含量下降，鹽溶性蛋白含量的變化能夠反映出蛋白質的變性程度[25]。在凍藏過程中，對照組由于直接與空氣接觸，鹽溶性蛋白變性嚴重。復合鍍冰衣具有抗氧化作用，相較于對照組蛋白質下降速度較慢，6個月后下降為26.5 mg/g。

圖3 復合鍍冰衣對鹽溶性蛋白的影響Fig.3 Effect of compound ice coating on salt soluble protein

2.5.3 色差的變化

貯藏期間金槍魚復合鍍冰衣和對照組的色差變化如圖4所示。新鮮金槍魚呈鮮紅色，在貯藏期間由于氧化作用，肌紅蛋白會被氧化成高鐵肌紅蛋白，導致魚肉褐變，紅度值變化[26]。隨著鍍冰衣貯藏時間的延長，金槍魚肉色(a*值)呈下降趨勢，復合鍍冰衣處理后的金槍魚下降比對照組慢。6個月后，復合鍍冰衣組和對照組a*值分別下降至6.2和4。對照組的金槍魚由于高鐵肌紅蛋白中含有的Fe3+在魚肉中沉積，魚肉褐變明顯[27]。

圖4 復合鍍冰衣對色差的影響Fig.4 Effect of compound ice coating on color difference

2.5.4 揮發性鹽基氮(TVB-N)的變化

在魚肉貯藏過程中，由于魚體內部細菌和內源酶的作用，蛋白質在分解過程中會生成含氮物質，即TVB-N[28]。對金槍魚TVB-N值的測量，能夠反映出金槍魚的腐敗程度，新鮮魚的TVB-N值在12 mg/100 g左右[29]。當海水魚的TVB-N值>30.0 mg/100 g時，即可認為不新鮮[30]。由圖5可以看出，復合鍍冰衣處理后的金槍魚TVB-N值上升明顯較對照組緩慢，貯藏6個月后，對照組金槍魚TVB-N值增加到22.37 mg/100 g，復合鍍冰衣組TVB-N增加18.29 mg/100 g。這是由于復合鍍冰衣中富含的乳酸鈉對細菌具有抑制作用，減緩TVB-N增加。在貯藏初期，TVB-N的值上升較慢，是因為貯藏前期魚體內源酶活性較低，微生物數量較少，隨著內源酶活性增強和微生物數量逐漸增加，TVB-N值在貯藏后期迅速上升[19]。

圖5 復合鍍冰衣對TVB-N的影響Fig.5 Effect of compound ice coating on TVB-N

3 結論

本實驗在單因素試驗的基礎上，選取合適的濃度范圍，采用Box-Behnken響應面分析法對金槍魚冰衣液進行復配，對實驗數據進行擬合，總模型方差顯著(P<0.05)，與預測值均無顯著性差異。迷迭香酸和乳酸鈉具有明顯的交互作用。根據得到的最佳配比(迷迭香酸質量分數0.2%，乳酸鈉質量分數3.4%，竹葉抗氧化物質量分數0.12%)，并對結果進行了驗證。實驗表明，采用最佳配比復合鍍冰衣后的金槍魚具有更好的持水力、鹽溶性蛋白和色差值，能夠顯著減少金槍魚肉色褐變，減緩TVB-N增加。迷迭香酸、乳酸鈉、竹葉抗氧化物之間具有很強的協同作用，采用最佳配比的復合鍍冰衣能夠保持金槍魚的新鮮度，延長金槍魚的貨架期。