硅量子點(diǎn)熒光傳感器快速檢測(cè)鮮奶中的四環(huán)素

楊彩玲，趙雪珺，李建穎，趙國(guó)虎，2，張麗，曹文濤

1(蘭州城市學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(“城市環(huán)境污染控制”甘肅省高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730070)3(西北師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

四環(huán)素(tetracycline，TET)是一種價(jià)格低廉且最為常用的廣譜性抗生素，能有效抑制革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌、立克次體、濾過(guò)性病毒、螺旋體和寄生蟲等感染[1]，作為飼料添加劑和治療藥物被大量用于預(yù)防和治療奶牛乳房炎等嚴(yán)重疾病，但使用不當(dāng)或?yàn)E用會(huì)導(dǎo)致牛奶中過(guò)量殘留，對(duì)消費(fèi)者健康造成危害，如引起過(guò)敏反應(yīng)或抗藥性、損害肝臟、使腸胃功能紊亂等[2-3]。國(guó)際衛(wèi)生組織、歐盟和我國(guó)規(guī)定四環(huán)素在牛奶中的最大殘留限量為100 μg/L[4-5]。但即使牛奶中殘留水平很低，長(zhǎng)期飲用也會(huì)在人體內(nèi)蓄積，增大健康風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)乳業(yè)自“三聚氰胺”事件之后，乳品質(zhì)量有了很大提高，但迄今為止，鮮牛奶中抗生素殘留超標(biāo)現(xiàn)象還時(shí)有發(fā)生，特別是一些個(gè)體散賣的鮮牛奶[6-9]，因此，監(jiān)測(cè)四環(huán)素在鮮牛奶中的殘留情況十分必要。現(xiàn)有的四環(huán)素殘留檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等[10]。酶聯(lián)免疫法抗體制備時(shí)間長(zhǎng)，穩(wěn)定性差；色譜法靈敏度高，可以多組分同時(shí)測(cè)定，但儀器昂貴、操作復(fù)雜耗時(shí)，還需要專業(yè)的操作人員，限制了它們?cè)诂F(xiàn)場(chǎng)和實(shí)時(shí)檢測(cè)中的應(yīng)用。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的四環(huán)素測(cè)定方法，對(duì)牛奶質(zhì)量控制具有重要意義。

近年來(lái)，基于量子點(diǎn)的熒光傳感分析方法因靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便及成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，已廣泛應(yīng)用于藥物殘留[11-14]、生物毒素[15]、違禁添加[16]等食品安全檢測(cè)。在抗生素檢測(cè)方面，毛永強(qiáng)[13]、YANG等[17]分別通過(guò)制備CdTe量子點(diǎn)和碳量子點(diǎn)對(duì)牛奶中的土霉素和魚肉中的四環(huán)素進(jìn)行了靈敏測(cè)定。相比于金屬半導(dǎo)體量子點(diǎn)和碳量子點(diǎn)，硅量子點(diǎn)(silicon quantum dots, SiQDs)不僅水溶性好，光穩(wěn)定性強(qiáng)，無(wú)毒，并且擁有高的熒光量子產(chǎn)率和豐富的硅源，在分析檢測(cè)、生物成像、藥物傳遞等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[18-21]。本文以水熱法合成硅量子點(diǎn)，利用四環(huán)素能有效猝滅硅量子點(diǎn)熒光，首次提出了基于硅量子點(diǎn)熒光傳感的四環(huán)素檢測(cè)新方法，應(yīng)用于鮮牛奶中四環(huán)素殘留的測(cè)定，并對(duì)傳感機(jī)理進(jìn)行了研究，旨在為四環(huán)素殘留的快速檢測(cè)提供一種新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TECNAIG2型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡，美國(guó)FEI公司；FLS920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀，英國(guó)EI公司；NEXUS 670型紅外光譜儀，美國(guó) Thermo Nicolet公司；RF-5301型熒光分光光度計(jì)，日本島津公司；Tu-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

無(wú)水檸檬酸、KCl、MgCl2、CaCl2、NaCl、硝酸鋅、FeCl3，廣州化學(xué)試劑廠；半胱氨酸、甘氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨酸、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)，上海阿拉丁試劑公司；磷酸、醋酸、硼酸、維生素C，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；四環(huán)素、土霉素、紅霉素，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；乳糖、EDTA，成都市科龍化工試劑廠。以上試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SiQDs的制備

SiQDs的制備參照文獻(xiàn)[22]并修改如下：在50 mL錐形瓶中加入5 mL 超純水，然后在攪拌下依次加入50 mg無(wú)水檸檬酸和1.0 mL AEAPMS，充分?jǐn)嚢韬髮⑸鲜龌旌先芤恨D(zhuǎn)移至聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜中，240 ℃反應(yīng)2 h，自然冷卻至室溫。準(zhǔn)確移取250 μL SiQDs 溶液加水稀釋并定容至50 mL，儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 熒光測(cè)定

在10 mL比色管中，依次加入一定體積不同濃度四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液和30 μL上述稀釋后的SiQDs溶液，用pH 7.0的B-R緩沖溶液稀釋定容至5.0 mL，搖勻，靜置1 min后在室溫及激發(fā)光波長(zhǎng)為370 nm條件下測(cè)定體系熒光光譜(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm)。根據(jù)lg(F0/F)與C(四環(huán)素濃度)繪制工作曲線(F0和F分別代表未加入和加入 TET 時(shí)的熒光強(qiáng)度)。

1.2.3 牛奶樣品的處理和測(cè)定

生鮮牛奶購(gòu)自當(dāng)?shù)?個(gè)不同散養(yǎng)售賣點(diǎn)。每個(gè)點(diǎn)相隔1 d購(gòu)買1份，各買3份，共收集樣品21份，所有樣品均于購(gòu)買當(dāng)天處理后冰箱冷藏保存。樣品處理過(guò)程為：準(zhǔn)確移取鮮奶5.0 mL，加入含有20 mmol/L EDTA的McIlvaine buffer 緩沖溶液(pH 5.0)3 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸2 mL，渦旋振蕩5 min，之后在4 ℃ 10 000 r/min下離心10 min以脫去蛋白質(zhì)，再向上清液中加入2 mL氯仿渦旋振蕩5 min以除去脂肪并再次離心。取上清液用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，經(jīng)0.45 μm微孔膜過(guò)濾后準(zhǔn)確移取4.5 mL,按1.2.2的方法制備待測(cè)樣品溶液進(jìn)行熒光測(cè)定，平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 量子點(diǎn)的形貌結(jié)構(gòu)、光學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性

a-SiQDs的TEM圖片;b-SiQDs的紅外光譜圖圖1 SiQDs 的表征Fig.1 Characterization of SiQDs

通過(guò)FLS920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀測(cè)量[23]并計(jì)算該量子點(diǎn)的絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率為18.93%。根據(jù)圖2-a SiQDs在不同激發(fā)波長(zhǎng)下掃描的發(fā)射光譜圖，該量子點(diǎn)發(fā)射峰位置與激發(fā)光無(wú)關(guān)，說(shuō)明所制備的SiQDs的發(fā)射光不具有激發(fā)光依賴特性，但發(fā)射光強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)的增加先增大后減小，在370 nm達(dá)到最大。SiQDs的紫外吸收光譜和熒光激發(fā)、發(fā)射光譜如圖2-b所示，230 nm 處出現(xiàn)的吸收峰可能是羰基發(fā)生π-π*電子躍遷引起，同時(shí)SiQDs 表面的官能團(tuán)發(fā)生n-π*躍遷造成了352 nm處出峰。SiQDs 最佳激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng)為465 nm；內(nèi)插圖顯示，SiQDs在自然光下接近無(wú)色，365 nm紫外光照射下發(fā)出明亮的藍(lán)光。

a-不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光光譜圖;b- UV-vis、熒光激發(fā)和發(fā)射光譜、自然光和365 nm下照片圖2 SiQDs的光譜圖Fig.2 The spectrum of SiQDs

測(cè)定不同酸度(pH 3～12)B-R緩沖溶液中SiQDs 的熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 3時(shí)，SiQDs 的熒光強(qiáng)度相對(duì)較低，pH 在4～9之間時(shí)，SiQDs 的熒光強(qiáng)度較高且穩(wěn)定；而當(dāng) pH>9 時(shí)，其熒光強(qiáng)度又逐漸增大。這主要是由于SiQDs 表面官能團(tuán)的質(zhì)子化-去質(zhì)子化作用引起的。此外，向溶液中加入一定濃度NaCl，觀察到SiQDs在鹽濃度為0～100 mmol/L的范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯改變。比較在370 nm 激發(fā)光連續(xù)照射0～30 min以及保持溶液溫度分別為20、25、35、45 ℃的條件下SiQDs的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)SiQDs的熒光強(qiáng)度基本不變，以上說(shuō)明所制備的SiQDs具有良好的穩(wěn)定性和強(qiáng)的抗光漂白能力。

2.2 溶液酸度和反應(yīng)時(shí)間的選擇

溶液酸度會(huì)影響量子點(diǎn)的發(fā)光性質(zhì)，通常也會(huì)影響量子點(diǎn)與目標(biāo)分析物之間的相互作用。圖3-a是在pH 3～12的測(cè)定體系中加入四環(huán)素后熒光猝滅效率(F0/F)隨pH變化的情況。可以看出，在所測(cè)試的pH范圍內(nèi)，pH=7時(shí)猝滅最好。因此，實(shí)驗(yàn)選擇在pH 7的B-R緩沖液中進(jìn)行測(cè)定。圖3-b是在pH為7的熒光測(cè)定體系中加入四環(huán)素分別反應(yīng)0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30 min后測(cè)定的熒光強(qiáng)度，由圖可見，猝滅在1min內(nèi)即可達(dá)到平衡，說(shuō)明利用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)四環(huán)素的快速檢測(cè)。

a-溶液酸度對(duì)體系熒光猝滅的影響;b-反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光猝滅的影響圖3 實(shí)驗(yàn)條件的選擇(cTET=6 μmol/L)Fig.3 Selection of experimental conditions

2.3 量子點(diǎn)對(duì)四環(huán)素的選擇性

2.4 樣品分析

2.4.1 工作曲線

按照1.2.2實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定加入不同濃度四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液后體系的熒光光譜，結(jié)果顯示：隨著四環(huán)素濃度的增加，體系熒光強(qiáng)度逐漸降低。四環(huán)素在0.05～90 μmol/L的濃度范圍內(nèi)與體系相對(duì)熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)lg(F0/F)呈良好線性關(guān)系，線性方程為lg(F0/F)=0.0118 4c+0.015 78，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 4, 檢出限為18 nmol/L (3σ/k)，低于鮮乳中規(guī)定的四環(huán)素限量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)含有6.0 μmol/L四環(huán)素的熒光體系平行測(cè)定8次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%，說(shuō)明該方法具有良好的重現(xiàn)性，能滿足實(shí)際樣品中四環(huán)素分析要求。

2.4.2 樣品測(cè)定結(jié)果及回收率

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定生鮮牛奶中四環(huán)素的殘留量。結(jié)果表明，21份生鮮奶中均未檢出四環(huán)素，一定程度上說(shuō)明該地區(qū)目前生鮮牛奶中四環(huán)素殘留風(fēng)險(xiǎn)較小。任取其中一份樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，加標(biāo)水平為75、100、200 μg/L，處理方法與樣品相同，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率為92.36%～104.07 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%～4.2%(表1)，表明所建立的方法準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際乳樣分析。

表1 四環(huán)素在生鮮奶中的回收率(n=6)Table 1 Recoveries of TET in fresh milksamples(n=6)

注：ND代表低于檢測(cè)限

2.5 猝滅機(jī)理

從圖4可以看出，SiQDs 的激發(fā)光譜在300～450 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)(曲線a)，四環(huán)素在此范圍內(nèi)有吸收，吸收峰位于355 nm(曲線b)，二者間有相當(dāng)程度的光譜重疊，滿足發(fā)生熒光內(nèi)濾的條件，可以推斷猝滅機(jī)理主要是內(nèi)濾效應(yīng)。因此，當(dāng)體系中加入四環(huán)素后，作為熒光體的SiQDs的激發(fā)光能量被熒光受體四環(huán)素有效吸收，導(dǎo)致體系熒光強(qiáng)度降低。

圖4 SiQDs 的熒光光譜(曲線a)和四環(huán)素的UV-vis吸收光譜圖(曲線b)Fig.4 Fluorescence spectra of SiQDs (curve a)andUV-Vis absorption spectra of TET(curve b)

由圖5可知，四環(huán)素在274 nm 和355 nm各有一個(gè)吸收峰，當(dāng)與SiQDs 相互作用后，274 nm的峰消失，355 nm的峰以及SiQDs 352 nm 的吸收峰發(fā)生紅移，說(shuō)明四環(huán)素分子與SiQDs中的羧基或氨基通過(guò)氫鍵作用形成了基態(tài)復(fù)合物，猝滅過(guò)程應(yīng)為靜態(tài)猝滅。因?yàn)閯?dòng)態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，而不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜[24]。

圖5 SiQDs、TET以及混合溶液的UV-vis吸收光譜Fig.5 UV-vis absorption spectra of the SiQDs，TET andthe mixture of the SiQDs and TET

進(jìn)一步通過(guò)測(cè)量加入四環(huán)素前后SiQDs 的熒光壽命進(jìn)行確定，發(fā)現(xiàn)加入四環(huán)素后SiQDs 的熒光壽命幾乎沒(méi)有改變(圖6)，說(shuō)明猝滅為靜態(tài)猝滅[25]。因此，可以認(rèn)為四環(huán)素對(duì) SiQDs 的熒光猝滅主要為內(nèi)過(guò)濾效應(yīng)和靜態(tài)猝滅協(xié)同作用的結(jié)果。

圖6 加入TET前后SiQDs 的時(shí)間分辨衰減曲線Fig.6 Time-resolved decay curves of SiQDs in theabsence and presence of TET

3 結(jié)論

本文通過(guò)水熱法一步合成了水溶性的熒光硅量子點(diǎn)，合成方法簡(jiǎn)單，避免了耗時(shí)的表面修飾過(guò)程，所合成的 SiQDs 具有良好的熱穩(wěn)定性、優(yōu)異的耐鹽性和抗光漂白能力。利用四環(huán)素與SiQDs之間存在內(nèi)過(guò)濾效應(yīng)和靜態(tài)猝滅的協(xié)同作用構(gòu)建了新型熒光傳感器用于鮮奶中四環(huán)素測(cè)定，方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，并且不需要昂貴的設(shè)備，為鮮奶中四環(huán)素殘留檢測(cè)提供了一種新思路。